青少期社會隔離和不確定性應激對大鼠成年后情緒行為的影響☆

管西婷謝希羅曉敏邵楓王瑋文

青少年期是從兒童期向成年期轉變的階段，也是個體神經和行為發育的關鍵階段［1］。臨床流行病學調查表明，有青少年期負性生活事件的人群在成年期罹患精神疾病的比率顯著高于正常人群［2］。但迄今為止，青少年期應激通過何種途徑或機制對精神疾病的發病產生長期的影響尚未明確。研究表明，自斷乳期持續至成年的社會隔離改變大鼠的社會行為、焦慮行為和自發活動性［3］。此外，以成年個體為實驗對象，研究證實慢性不確定性應激能夠誘導大鼠明顯的情緒行為改變［4］。因此，本研究旨在比較特定發育階段—青少期社會隔離和不確定性應激對大鼠成年后情緒行為的長期影響，篩選和建立青少期應激增加成年大鼠情緒障礙易感性的動物模型，為進一步研究其神經機理提供實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗動物和分組 鼠齡24 d(Post natal day，PND24)雄性SD大鼠40只，購自中國軍事醫學科學院實驗動物中心。所有動物在SPF級動物實驗室內飼養，控制環境溫度(22±1)℃，濕度(50±5%)，12 h明∕暗周期(7:00/19:00)。動物到達實驗室3 d后(PND28)開始實驗。實驗期間除了行為測試和應激處置自由進水飲食飼養。根據研究文獻，嚙齒類動物出生后28～56 d大致對應于人類的青少年期［1］，因此本研究選擇在PND28～41給予青少期大鼠兩周應激刺激，包括社會隔離和不確定性應激兩個實驗。所有實驗程序已通過中國科學院心理研究所動物管理和使用委員會審核和批準。

1.2 實驗程序

1.2.1 實驗一 20只大鼠隨機分為社會隔離組和群養組各10只。既往研究表明飼養環境因素顯著影響社會隔離的效果，一般來說更為單調的飼養環境產生更為明顯的行為和生理改變［5］。本研究采用與我們以往報道相同的社會隔離范式［6］。社會隔離組動物單獨飼養于不透明的乳白色塑料盒中(45 cm×30 cm×20 cm)，使得隔離大鼠間無視覺及觸覺接觸;除了每周一次更換墊料外與工作人員無任何接觸，嚴格控制實驗人員和飼養人員進出等以保證社會隔離的效果。其相應對照組為群養組(3～4只/盒)。群養組與隔離應激組同屋放置以保持飼養環境的一致性。在2周社會隔離結束后，社會隔離組恢復群養(3～4只/盒)直至成年。

1.2.2 實驗二 20只大鼠隨機分為不確定性應激組及對照組各10只。不確定性應激與我們以往研究采用的范式類似［7］。兩組大鼠分別置于不同的房間，單籠飼養于不銹鋼柵欄籠中，動物之間可以有視覺、聽覺和軀體接觸。不確定性應激包括多種復合刺激，如食物和水剝奪，傾斜籠子(45度)，持續照明或明暗顛倒，潮濕墊料，變動的配對關系，頻閃燈(180次/min)，空瓶刺激(水剝奪后空水瓶刺激1 h)，限制進食(2粒，食物剝奪后3 h給予)，熱環境(37℃，30 min)，冷刺激(8℃，30 min)。刺激隨機安排于一周內，每日2～5種，共給予兩周。對照組動物正常飼養，且隔天撫摸2min保持與應激組類似的操作性接觸。青少期應激結束后經3周恢復至所有動物成年后(＞PND 62)檢測其情緒行為。

1.3 抑郁樣行為檢測 ①糖水偏好測試:在PND62－63，經20 h隔夜飲水剝奪后，所有動物進行1 h雙瓶測定(一瓶飲用水，一瓶1%蔗糖水溶液)，測量動物飲用水和糖水的攝入量。其中社會隔離組和群養組在檢測前4 h在同一房間單籠分養。糖水偏好指數(一種反映快感缺乏程度的指標)為糖水攝入量與總的液體攝入量之比。隨后恢復正常攝食和飲水;②強迫游泳測試:在下述焦慮行為測試結束后進行(PND65－66)。第一天前測階段(PND65)，所有動物在水深30 cm、水溫23～24℃的圓形玻璃缸中(直徑25 cm，高50 cm)強迫游泳15min，隨后將動物拭干并放回籠中。每只動物訓練后均更換新水。第二天檢測階段(PND66)，再次將動物放入水中強迫游泳5 min，并攝像。隨后定義每5 s間隔內如下行為:不動/漂浮行為，掙扎/攀爬行為和游動行為。由不明確本實驗分組者統計上述行為出現次數。

1.4 焦慮樣行為檢測 ①曠場測試:在PND64，將動物置于高50 cm、直徑180 cm的圓形曠場中。記錄大鼠在曠場內5 min的行為表現，包括水平活動距離和直立次數。其中水平活動距離通過行為跟蹤分析系統自動獲取，直立次數直接觀察記錄并通過錄像校驗。②高架十字迷宮測試:在曠場測試后進行。裝置高50 cm，開放臂為110 cm×10 cm×10 cm(長 ×高 ×寬)，閉合臂為110 cm×10 cm×10 cm(長×高×寬)。每次測試都將大鼠面向開放臂置于迷宮中央區。測試時間為5 min，通過計算機監測系統自動記錄開放臂進入次數和停留時間，閉合臂進入次數和停留時間。

1.5 統計方法采用SPSS 13.0處理實驗數據。所有數值以均值±標準誤(M±SE)表示。采用獨立樣本t檢驗比較社會隔離組與群養組、不確定性應激組與對照組的組間差異。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 青少期社會隔離對大鼠成年后抑郁樣行為的影響 與群養組相比，青少期社會隔離組大鼠成年后的糖水偏好指數(t=1.60，P＞0.05)、強迫游泳測試中的攀爬行為((t=－0.40，P＞0.05)、游動行為(t=0.63，P＞0.05)和不動行為(t=0.20，P＞0.05)均無差異。見表1。

2.2 青少期社會隔離對大鼠成年后焦慮樣行為的影響 與群養組相比較，青少期社會隔離組大鼠成年后在曠場測試中的水平運動距離和直立次數無明顯差異(t=0.47，P＞0.05;t= －0.59，P＞0.05)，兩組間在高架十字迷宮測試中的閉合臂進入次數(t=－2.09，P＞0.05)和停留時間(t=－0.09，P＞0.05)以及開放臂進入次數(t=－0.53，P＞0.05)和停留時間(t=0.52，P＞0.05)也均無差異。見表1。

2.3 青少期不確定性應激對大鼠成年后抑郁樣行為的影響 與對照組相比，經歷青少期不確定性應激的研究組大鼠成年后糖水偏好指數沒有明顯差異(t=－0.05，P＞0.05)，而在強迫游泳測試中不動行為明顯增加(t=2.14，P＜0.05)而掙扎行為明顯減少(t=－2.36，P＜0.05)。見表2。

2.4 青少期不確定性應激對大鼠成年后焦慮樣行為的影響 t與對照組相比，經歷青少期不確定性應激的研究組大鼠成年后在高架十字迷宮閉合臂的停留時間明顯增加(t=2.29，P＜0.05)而開放臂的進入次數明顯減少(t=－2.14，P＜0.05)。見表2。

3 討論

本研究比較了青少期社會隔離和不確定性應激對大鼠成年后各種情緒行為的長期影響。分別采用糖水偏好測試和強迫游泳測試檢測快感缺乏和不可逃避的急性應激情境下無助、絕望行為以反映動物的抑郁水平;采用曠場和高架十字迷宮測試以檢測動物的焦慮水平，這些指標都已被證實可以作為評價動物情緒行為的有效指標［8］。

表1 青少期社會隔離對大鼠成年后抑郁樣行為及焦慮樣行為的影響 M±SE

表2 青少期不確定性應激對大鼠成年后抑郁樣行為及焦慮樣行為的影響 M±SE

研究結果表明，青少期(PND28～41)2周的社會隔離飼養對大鼠成年后各項所檢測的抑郁樣和焦慮樣行為均缺乏明顯的作用。以往研究采用的社會隔離應激大多從斷乳期(通常在出生后21 d～28 d)持續至成年期(＞出生后56 d)，跨越了兒童期、青少期和成年期多個發育階段，且通常在社會隔離狀態下進行各項指標的檢測。因此，無法區分社會隔離誘導的行為和生理改變是由于早期發育階段社會隔離的長期后果抑或只是當前社會剝奪狀態的作用［5］。近年來，一些研究開始探討特定發育階段短暫的社會隔離應激對大鼠成年后情緒行為的影響，但研究得到的結果并不一致。例如，有研究發現斷乳后(出生后21～28 d)開始的2到3周的社會隔離應激并不影響大鼠成年后曠場自發活動性和/或高架十字迷宮行為［9－10］。與此一致，本研究也發現在青少期早期(PND28～41)經歷兩周社會隔離并未造成對成年大鼠上述行為的長期影響。也有研究報道，在青少期晚期(PND38～51)經歷兩周社會隔離的大鼠成年后高架十字迷宮行為沒有明顯改變，但曠場自發活動水平明顯增加(水平運動距離增加)［6］。這些提示社會隔離應激對大鼠情緒行為的影響也可能與應激發生的時間有關。此外，既往研究大多發現從斷乳期直至成年(＞4周)的社會隔離對成年大鼠的快感缺乏和強迫游泳誘導的絕望行為等典型抑郁樣行為的作用不顯著［11－12］。本研究的結果也表明短暫的2周青少期社會隔離應激對成年大鼠的上述行為缺乏明顯作用。總之，本研究結果提示，青少期早期(PND28～41)社會隔離對大鼠成年后的焦慮與抑郁樣情緒行為缺乏長期影響。

本研究結果顯示，經歷青少期(PND28～41)不確定性應激的成年大鼠與其對照組相比糖水偏好指數沒有明顯改變，但在強迫游泳測試中表現出更多的絕望行為(不動行為增加)和更少的主動行為(掙扎行為減少)。盡管以成年個體為實驗對象，研究已證實慢性不確定性應激模型具有較好的擬人類抑郁癥的表面效度、結構效度和預測效度［4］，但是不確定性應激對青少期大鼠情緒行為的長遠影響幾無研究涉及。在Pubmed數據庫中，僅檢索到一項研究報道兒童期至青少期的不確定性應激導致雌性而非雄性大鼠成年后降低的糖水偏好和掩埋行為(一種焦慮行為指標)以及增強的急性應激誘導的神經內分泌反應［13］。與此一致，本研究也發現青少期不確定性應激不影響雄性大鼠成年后糖水偏好行為。但在強迫游泳應激條件下，經歷青少期不確定性應激的成年雄性大鼠表現出明顯的抑郁樣行為，提示青少期不確定性應激并不影響大鼠成年后偏好糖水的本能行為，但導致其應激應對能力受損，對成年應激事件更容易發展出次級的應對無能或無助的抑郁樣行為。其他早期應激相關研究也發現，新生期母嬰分離應激并不影響成年大鼠的糖水偏好指數［14］。但經歷母嬰分離應激的成年動物在強迫游泳測試中的不動/漂浮時間明顯多于對照組大鼠，也提示經歷母嬰分離應激的成年大鼠具有行為絕望的高易感性［14－15］。此外，經歷青少期不確定性應激的大鼠成年后在高架十字迷宮測試中閉合臂停留時間增加和開放臂進入次數減少，提示該應激同時增加了大鼠成年后的焦慮樣行為水平。

綜上所述，青少期社會隔離應激和不確定性應激對大鼠成年后情緒行為的影響存在明顯差異，青少期不確定性應激能夠有效誘導成年大鼠多項情緒行為顯著和持續的改變，提供了一種研究青少期應激增加成年大鼠應激性抑郁易感性的動物模型。

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