立體定向移植骨髓間充質(zhì)干細胞對腦缺血再灌注模型大鼠的治療作用☆

曹文鋒 王衛(wèi)真 高幼奇 楊赟 張洪連 劉詩英 何丹 吳曉牧

研究骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)治療腦梗死已有半個世紀之久，且取得了一定的成果即證實BMSCs對腦梗死所致神經(jīng)功能缺失具有一定的改善作用［1－4］。雖然BMSCs治療腦梗死的途徑主要有靜脈、動脈和立體定向途徑，但立體定向途徑因其操作過程較復雜且技術(shù)性高是目前研究最少的一種途徑。同時，BMSCs治療腦梗死的具體作用機制目前還不是很清楚，故本文研究立體定向途徑移植BMSCs對腦梗死模型大鼠的療效并進一步探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 BMSCs的體外培養(yǎng)、Brdu標記及鑒定 2～4周齡的SD大鼠(上海西普爾－必凱實驗動物有限公司)，游離雙側(cè)后肢股骨和脛骨，用含10%FBS(Hyclone)的DMEM/F12(1∶1)(Sigma)培養(yǎng)基沖洗骨髓腔，然后直接接種于培養(yǎng)瓶。第2代(p2)的BMSCs在移植前用10 μmol/L的Brdu(Sigma)孵育48 h以示蹤標記，同時在體外用直接免疫熒光檢測上述BMSCs的Brdu標記率。流式細胞術(shù)檢測p2期BMSCs的表面抗原 CD29、CD106、CD45、CD 90、CD11b(Biolegend)、CD 34(Santa Cruz)陽性細胞數(shù)。

1.2 MCAO模型的建立與分組 10%水合氯醛麻醉大鼠，鈍性分離右側(cè)的頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，然后用直徑0.26 mm的尼龍線從頸外動脈插入，再穿過頸內(nèi)動脈直至大腦中動脈(MCA)的起始處，進線深度約17～18 mm，阻斷MCA血供2 h后再拔出尼龍線恢復再通。按隨機數(shù)字表將14只成年SD大鼠分成BMSCs組(n=8)和PBS組(n=6)。

1.3 BMSCs移植 建模后7 d，再次麻醉大鼠，固定于立體定向儀上(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司)，用牙科鉆在右側(cè)顱頂鉆A、B、C三孔［A孔:正中線偏右(R)3 mm，前囟前(AP)+2 mm，硬腦膜下(DV)3 mm;B孔:R 3 mm，AP+0.5 mm，DV 5 mm;C孔:R 3 mm，AP －1.0 mm，DV 3 mm］，用微量泵(上海高鴿工貿(mào)有限公司)緩慢注射3×106BMSCs/15 μLPBS(A孔4 μL，B 孔7 μL，C 孔4 μL)，注射完后針停留5 min 再緩慢拔出，骨蠟封閉鉆孔縫合傷口。PBS組注射15 μLPBS。術(shù)后大鼠未給予免疫抑制藥和抗生素。

1.4 行為功能學評分及體重比較 大鼠于建模前和建模后1、7、14、21、28、35 d 分別進行以下檢查:①粘附實驗［2］，建模前訓練3 d，如果能在10 s內(nèi)撕下粘紙則開始建模;② mNSS評分［2］，建模后1 d mNSS評分為7～12分的大鼠納入本實驗;③記錄大鼠的體質(zhì)量。

1.5 腦梗死體積的測量 建模后35 d處死大鼠，4%多聚甲醛灌注取腦，并固定48 h。用腦槽沿冠狀位將腦連續(xù)切成厚度均為2 mm的7塊，再脫水、透明、浸蠟、最后包埋成蠟塊。每個蠟塊每隔54 μm切一張6 μm厚的切片做HE染色，然后用ipwin32圖像分析軟件(武漢千屏影像技術(shù)有限責任公司)計算腦梗死體積(對側(cè)腦半球體積減去梗死側(cè)腦半球體積再除以對側(cè)腦半球體積)。

1.6 組織學和免疫組織學染色 選擇前囟位置的蠟塊(即腦梗死中心部位)，切數(shù)張4～6 μm厚的切片進行以下染色:①Bielshowsky's-Luxol Fast Blue staining雙染:切片常規(guī)脫蠟至水，置于10%AgNO3避光15 min，氨水還原，甲醛顯色，硫代硫酸鈉分化和固定，然后再置于1%the luxol fast blue(Sigma)染液56℃過夜，95%酒精漂洗，0.005%Li2CO3和70%酒精分化，焦油紫(New Jersey)復染，最終神經(jīng)軸突和髓鞘分別染成為黑色和藍色;②免疫組織熒光:2N HCl 30 min裂解雙鏈 DNA，5%BSA 封閉 1 h，Rabbit anti-Brdu(1∶150，北京博奧森生物技術(shù)有限公司)4℃過夜;③免疫組織化學:3%H2O2滅活，檸檬酸緩沖液(pH6)高壓修復5 min，一抗4℃過夜，包括抗 Ki-67(1∶200)和 GFAP(1∶400)(北京中杉金橋)，抗 Nogo-A(1∶1000)、NSE(1∶250)、VEGF(1∶1200)和 SYN(1∶400)(abcam 公司)，滴加二抗和DAB顯色(二步法兔免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋)，按照說明書操作。

1.7 圖片采集與計數(shù) 采用醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)分別對Bielshowsky's-Luxol Fast Blue staining雙染、免疫組化和免疫熒光的組織切片按如下條件采圖與計數(shù):①測量腦缺血半暗帶區(qū)(IBZ區(qū))(40×物鏡)NSE、Nogo-A、VEGF、SYN、GFAP、Brdu 的陽性細胞數(shù);②測量腦室管膜下區(qū)(SVZ區(qū))6個區(qū)域(40×物鏡)Ki-67的陽性細胞數(shù);③測量IBZ區(qū)6個區(qū)域(10×物鏡)膠質(zhì)瘢痕的厚度。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件，數(shù)據(jù)用±s表示，用t檢驗分析數(shù)據(jù)，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs體外形態(tài)、Brdu標記及鑒定 BMSCs在體外成集落式貼壁生長，形態(tài)呈不規(guī)則梭形。第二代BMSCs用含有10 μmol/L的Brdu培養(yǎng)基孵育48 h后陽性細胞率達96.3%。流式細胞術(shù)鑒定結(jié)果:高表達CD90、CD29，中度表達 CD106，低表達 CD34、CD45、CD11b。

2.2 行為功能學評分及體質(zhì)量比較 BMSCs組大鼠在腦梗死后35 d的體質(zhì)量顯著高于PBS組(圖1A)，28 d的mNSS評分和粘附實驗的撕紙時間明顯低于PBS組(圖1B、C)。

圖1 行為功能學評分及體質(zhì)量比較。A:體質(zhì)量比較;B mNSS評分;C:粘附實驗;PBS組與BMSCs組比較*P＜0.05

2.3 Bielshowsky's-Luxol Fast Blue雙染 髓鞘和軸突分別染成藍色和黑色。建模后35 d，腦組織梗死側(cè)可見液化腔形成，IBZ區(qū)神經(jīng)纖維再生增強，且BMSCs組的神經(jīng)纖維的再生能力優(yōu)于PBS組(圖2A、B)。

2.4 腦組織中Brdu標記的 BMSCs BMSCs組IBZ區(qū)可見大量 Brdu+-BMSCs，數(shù)量約為(239.12+35.59)，同時可見少量胞漿呈陽性的大細胞，可能是巨噬細胞吞噬降解壞死的BMSCs后Brdu在胞漿內(nèi)沉積的結(jié)果。BMSCs組梗死對側(cè)和PBS組未見Brdu+-BMSCs(圖3A、B)。

2.5 組織免疫化學檢測和腦梗死體積 ①BMSCs組與PBS組比較，IBZ區(qū) GFAP陽性細胞數(shù)(51.38±7.37)顯著升高 PBS組(41.33±9.03，P＜0.05)(圖4A，B)，IBZ外側(cè)區(qū)的膠質(zhì)瘢痕厚度(141.00±28.00 mm)與PBS組(156.00±41.00)比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，圖4C，D);②BMSCs組的腦梗死體積百分比(30.30±3.53)與PBS組(33.00±2.18)比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05);③BMSCs組IBZ區(qū)的Nogo-A陽性細胞數(shù)(43.12±7.06)顯著低于PBS組(53.00±7.32，P ＜0.05)(圖 5A，F(xiàn));④BMSCs組 IBZ區(qū)的VEGF陽性細胞數(shù)(27.12±2.48)顯著高于 PBS組(16.17±5.85，P＜0.05)(圖4B，G);⑤BMSCs組 IBZ區(qū)的SYN陽性細胞數(shù)(70.00±7.29)顯著高于PBS組(53.00±5.44)(圖4C，H);⑥BMSCs組 IBZ 區(qū)的 NSE陽性細胞數(shù)(30.88±4.36)與PBS組(26.50±4.55)比較無統(tǒng)計學差異(P＞0.05，圖4D，I);⑦BMSCs組腦室管膜下區(qū)(SVZ區(qū))Ki-67陽性細胞數(shù)(28.00±5.47)顯著高于 PBS組(20.00±4.94，P＜0.05)(圖4E，J)。

圖2 Bielshowsky's-Luxol Fast Blue雙染。A:PBS組;B:BMSCs組;標尺 =100 μm

圖3 IBZ區(qū)Brdu+-BMSCs(免疫熒光染色)。A:100X;B:紅箭頭為死亡的BMSCs，藍箭頭為存活的BMSCs(400×)

3 討論

BMSCs是存在于骨髓中的一系列基質(zhì)干細胞的混合群體。研究證實BMSCs具有向外胚層來源的神經(jīng)系細胞定向分化和分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子的潛能［5－6］，且具有取材方便、易培養(yǎng)、低免疫原性、不存在倫理問題等優(yōu)點［7］。因此，選擇BMSCs移植治療腦梗死具有極大的可行性和優(yōu)越性。

BMSCs移植入體內(nèi)后在腦組織中具體存活量和時間與其療效的長短密切相關(guān)。有學者發(fā)現(xiàn)靜脈移植BMSCs治療腦梗死大鼠14 d后腦組織中約有14%的細胞存活且神經(jīng)功能明顯好轉(zhuǎn)［8］，而動脈移植14 d后約有20%的細胞存活且對腦梗死的療效較前者稍好［9］，本文立體定向移植3×106BMSCs治療腦梗死大鼠35 d后約有35%的移植細胞存活且神經(jīng)功能改善明顯，雖可見部分細胞壞死并被巨噬細胞吞噬降解。相關(guān)學者研究發(fā)現(xiàn)BMSCs對腦梗死的療效至少可維持一年，且1年后大腦內(nèi)仍有BMSCs存活［2］。

研究發(fā)現(xiàn)腦梗死后3 h、6 h、24 h等急性期內(nèi)移植BMSCs能顯著縮小腦梗死體積［1，10－11］，但腦梗死后 4 d、7 d、14 d、30 d等急性期后移植 BMSCs，腦梗塞體積與對照組比較未見明顯縮小［10，12－13］。因此，BMSCs 治療腦梗死能否縮小梗死體積可能與移植時間窗密切相關(guān)。急性期因缺血半暗帶區(qū)部分神經(jīng)組織損傷為可逆性，BMSCs自分泌或促使內(nèi)源性細胞分泌多種營養(yǎng)因子可挽救該部分神經(jīng)組織，進而縮小梗死體積［4，10，14］。急性期后神經(jīng)組織損傷已不可逆，故本文腦梗死后7 d移植BMSCs，雖然行為學功能獲得顯著好轉(zhuǎn)，但腦梗死體積未見縮小。

圖4 IBZ 區(qū)GFAP 陽性細胞數(shù)和膠質(zhì)瘢痕厚度。A、C:PBS組，B、D:BMSCs組;標尺:A、B 為100 μm，D、E 為50 μm

圖5 Nogo-A、VEGF、SYN、NSE、Ki-67陽性細胞數(shù)(免疫組化)。A ～E:BMSCs組;F～J:PBS組;標尺 =100 μm

BMSCs在腦組織中相當于微型的“生物分子工廠”，自分泌以及促使實質(zhì)細胞如星形膠質(zhì)細胞分泌大量細胞因子，主要有抗炎癥反應因子如IL-10、IL-6［14］，神經(jīng)營養(yǎng)因子如 BDNF、NGF、bFGF、VEGF，以及免疫調(diào)節(jié)因子［4，10］。這些細胞因子在腦梗死早期主要起神經(jīng)保護作用，而在腦梗死晚期則主要是增強神經(jīng)組織的內(nèi)源性修復，包括增加IBZ區(qū)新生血管形成，激活內(nèi)源性神經(jīng)干細胞或前體細胞(NSPCs)的增殖分化，增強神經(jīng)軸突和髓鞘的生長，縮小膠質(zhì)瘢痕厚度等［2，9，11－13］。本文發(fā)現(xiàn) BMSCs 治療后，SVZ 區(qū)的增殖細胞核抗原Ki-67陽性細胞數(shù)明顯增多，同時IBZ區(qū)GFAP表達率升高，同樣證實了 BMSCs能夠增強NSPCs和星形膠質(zhì)細胞的增殖，以參與神經(jīng)功能的恢復。

腦梗死急性期大鼠的行為功能受損明顯，雖缺失的神經(jīng)功能具有一定的自我恢復能力，但空間非常有限，主要原因是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的少突膠質(zhì)細胞分泌的Nogo-A和星形膠質(zhì)細胞在病灶周邊形成的膠質(zhì)瘢痕對軸突和髓鞘的生長具有抑制作用［15－16］。本文發(fā)現(xiàn)BMSCs治療后少突膠質(zhì)細胞細胞分泌的Nogo-A明顯減小，但病灶邊緣的膠質(zhì)瘢痕厚度并未縮小。其他學者發(fā)現(xiàn)移植BMSCs治療腦梗死1年后IBZ區(qū)Nogo-A的表達顯著降低，而且膠質(zhì)疤痕厚度縮小［2］。這種差異的可能原因為本文觀察時間較短(35 d)，未達到BMSCs縮小膠質(zhì)瘢痕厚度所需時間。本文采用Bielshowsky-Luxol Fast Blue staining雙染證實BMSCs治療后IBZ區(qū)的神經(jīng)纖維(軸突與髓鞘)再生增強。因此BMSCs通過衰弱Nogo-A和膠質(zhì)瘢痕對神經(jīng)纖維生長的抑制作用，增強神經(jīng)纖維再生和新的突觸聯(lián)系的建立，參與改善神經(jīng)功能。

總之，本文證實立體定向途徑移植BMSCs能改善腦梗塞大鼠受損的神經(jīng)功能，并其治療機制包括增強內(nèi)源性細胞增殖、突觸重建、神經(jīng)纖維修復和星形膠質(zhì)細胞保護作用等。

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