丹參紅花提取物對D-半乳糖致衰老小鼠學習記憶的調節作用

邵榮姿，劉召紅，張儉儉

生物體衰老是一復雜的、具有不同器官和系統的數不清的一系列特定變化的過程。大量事實證明，人體衰老存在學習記憶減退和認知障礙。動物實驗研究也表明，衰老與認知功能障礙密切相關。D-半乳糖（D-galactose，D-gal）致衰老模型，是較有代表性的癡呆動物模型。

丹參紅花提取物商品名丹紅注射液，是把中藥丹參、紅花按科學配方提取的復方制劑。中藥丹參的主要功效是活血化瘀，而紅花具有活血通絡、祛瘀鎮痛之功效，二者均為治療胸痹的常用藥。丹紅注射液能夠明顯緩解心絞痛癥狀，改善心肌缺血情況，且在臨床應用治療過程中未發現不良反應，為治療冠心病心絞痛之高效、安全的理想藥物[1]。本文介紹用D-gal致的衰老小鼠學習記憶減退模型為研究對象，采用Y型迷宮和跳臺檢測學習記憶功能，同時測定超氧化物歧化酶 （SOD）和丙二醛（MDA）含量，探討丹參紅花提取物對D-gal致小鼠衰老模型學習記憶的調節作用，為其進一步應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 丹參紅花提取物由由陜西步長集團提 供 ， 國 藥 準 字 號 Z20026866；SOD (批 號 ：20070119）、MDA（批號：20061203）檢測試劑盒均采用南京建成生物工程研究所產品。

1.1.2 儀器 儀器YLS-3T跳臺記錄儀 （山東省醫學科學院設備站）；Y型迷宮（江蘇省張家港市生物醫學儀器廠）；2550型紫外分光光度計（日本島津公司）。

1.1.3 動物 SPF級C57BL/6J小鼠60只，雌雄各半，4月齡，均由山東大學實驗動物中心提供，動物合格證編號：SCXK魯20030004。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組與給藥 C57BL/6J小鼠60只，隨機分為5組，每組12只，自由進食和飲水，經過1周適應期后給藥。分組給藥情況如下：正常對照組、模型對照組、丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d）、丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d）、丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d）。其中，模型對照組和丹參紅花提取物組皮下注射D－gal（0.5 g/kg·d）后，丹參紅花提取物組每日灌服藥物，而正常對照組和模型對照組每日灌服等量生理鹽水，連續給藥8周，再進行實驗。

1.2.2 跳臺實驗 小鼠第1次受電擊后跳下平臺的時間(潛伏期)，此即學習能力測驗。24 h后重復試驗，此即記憶保持測驗（24 h潛伏期）。具體操作按儀器說明進行。

1.2.3 水迷宮實驗 小鼠第1次受電擊后逃到安全區的時間（潛伏期）。24 h后重復試驗，以此作為記憶保持試驗（24 h潛伏期），此即記憶能力。具體操作按儀器說明進行。

1.2.4 血漿、組織SOD、MDA活力測定 用乙醚麻醉小鼠后，從眼球取血，置于肝素化的試管中。將血液以1 500 r/min離心10 min，吸取上層血漿用于測定SOD及MDA含量。而后脫臼處死小鼠，取出腦、肝、腎臟以及后肢肌肉，用冰冷的生理鹽水沖洗后凍存于液氮中備用。SOD、MDA按試劑盒說明書測定。

2 結 果

2.1 丹參紅花提取物對小鼠體重的影響 與模型對照組相比，丹參紅花提取物對D-gal致衰老模型小鼠體重的影響無顯著性差異（P>0.05）。

2.2 丹參紅花提取物對小鼠跳臺測試的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠跳臺測試錯誤次數明顯增多（P<0.01）；與模型對照組相比，丹參紅花提取物高、中劑量組能明顯降低D-gal致小鼠衰老模型的跳臺錯誤次數（P<0.05）；低劑量組也能不同程度地降低D-gal致小鼠衰老模型的跳臺錯誤次數，但無顯著性差異（P>0.05）。見表1。

2.3 丹參紅花提取物對小鼠迷宮測試的影響 與正常對照組比較，模型對照組小鼠迷宮測試潛伏期明顯延長，迷宮測試錯誤次數明顯增多 （P<0.05）；與模型對照組相比，丹參紅花提取物高劑量組能明顯降低D-gal致小鼠衰老模型的迷宮測試潛伏期和錯誤次數（P<0.05，P<0.01），中、低劑量組均能不同程度地降低D-gal致小鼠衰老模型的迷宮測試潛伏期和迷宮測試錯誤次數，但無顯著性差異（P>0.05）。見表2。

2.4 丹參紅花提取物對氧化抗氧化指標的影響

與正常對照組比較，模型對照組小鼠血液、肝、腦、腎臟中，MDA含量顯著增高 （P<0.05），SOD活力顯著降低（P<0.05）；與模型對照組相比，丹參紅花提取物高劑量組MDA活力顯著提高 （P<0.05），SOD活力提高非常顯著（P<0.05，P<0.01）。與模型對照組相比，中、低劑量組MDA含量與SOD活性產生相同趨勢變化，但變化不顯著。見表3、4。

表1 小鼠跳臺實驗結果（±s）

表1 小鼠跳臺實驗結果（±s）

與模型對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組 別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12潛伏期（h） 錯誤次數 24 h潛伏期 24 h錯誤次數2.43±1.15 2.23±0.73# 205.25±60.88* 1.87±0.64*3.10±1.52 4.33±1.61 190.5±89.84 2.88±0.89 2.29±0.94 3.23±1.35 232.75±96.65 2.21±1.21 2.24±1.28 2.97±1.35* 160.00±78.37* 2.00±1.43 3.20±1.17 2.28±1.54# 151.11±74.21# 1.97±1.57*

表2 小鼠水迷宮實驗結果（±s）

表2 小鼠水迷宮實驗結果（±s）

與模型對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組 別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12潛伏期（h） 錯誤次數 24 h潛伏期 24 h錯誤次數11.52±2.58* 24.25±7.12* 8.39±2.87* 14.98±6.88*28.82±10.95 37.32±11.65 16.35±5.01 17.55±4.75 27.90±9.88 34.32±7.42 16.48±8.42 16.99±5.76 27.59±7.35 33.12±9.77 15.77±5.54 15.85±5.91 21.98±6.88* 31.99±9.87* 11.27±2.81# 14.75±7.54*

表3 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中MDA含量（±s，nmol/mg）

表3 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中MDA含量（±s，nmol/mg）

與模型對照組比較，*P<0.05

組 別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12 MDA血漿 肝 腦 腎 肌肉5.14±1.18* 0.89±0.44* 1.60±0.32 0.87±0.17* 0.90±0.29 8.35±2.35 1.27±0.24* 1.82±0.50* 1.14±0.21* 1.21±0.21*7.02±0.61 1.08±0.17 1.68±0.31 1.03±0.23 1.22±0.31 6.98±0.48 0.99±0.18 1.59±0.24 0.99±0.20 1.01±0.15 5.69±0.58* 0.93±0.22* 1.41±0.25 0.82±0.18 0.92±0.14*

表4 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中SOD活性（U/mg，±s）

表4 小鼠血漿、肝、腦、腎、肌肉組織中SOD活性（U/mg，±s）

與模型對照組比較，*P<0.05，#P<0.01

組別 n正常對照組 12模型對照組 12丹參紅花提取物低劑量組（10 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物中劑量組（20 mg/kg·d） 12丹參紅花提取物高劑量組（40 mg/kg·d） 12 SOD血漿 肝 腦 腎 肌肉652.8±22.5* 69.2±4.8* 138.1±13.1* 47.3±3.9* 70.9±8.4 584.2±35.4 60.4±2.1 120.1±11.8 40.6±2.5 72.2±4.1 594.7±23.2 60.4±3.9 122.1±12.6 40.8±2.7 70.7±8.2 654.7±25.0 64.7±4.0 130.1±15.6 44.9±3.3 70.6±7.9 662.6±51.8# 69.8±5.8* 133.1±16.2* 45.1±2.7* 72.5±5.7

3 討 論

衰老是分子、細胞、器官乃至機體整體功能衰退綜合的復雜生理、病理變化過程。衰老的機制十分復雜，但是自由基致衰老的理論得到了學者們的認可。該理論認為，機體在細胞代謝過程中不斷產生的自由基，具有極強的氧化能力，會損傷蛋白質、核酸等生物大分子并引起結構和功能的改變，最終導致生物體整體衰老[2]。在生物體衰老過程中，神經系統也逐步發生衰退，進而產生學習記憶能力下降等現象，這是衰老的重要特征之一。因此，尋找開發提高學習記憶能力的方法和藥物，是抗衰老藥理學和神經科學的重要內容。

D-半乳糖致衰老小鼠由我國提出并在國際上得到認可，該模型小鼠表現由衰老、學習記憶功能障礙、免疫功能低下等一系列自然衰老的現象，是進行學習記憶功能、衰老等研究的良好模型，D-半乳糖誘發動物衰老和癡呆樣行為及病理性改變的研究頗多，其發生機制與氧化應激損傷和自由基毒性有關。D-半乳糖作為氧化性物質，大劑量注射后可在細胞內被醛糖還原酶催化還原成過多的半乳糖醇，后者在細胞內堆積而影響細胞正常滲透壓，導致細胞腫脹和功能障礙。同時，D-半乳糖可誘發體內自由基蓄積，使得蛋白、脂質及核酸過氧化，引起線粒體結構損傷和功能紊亂，出現能量代謝障礙，導致細胞損傷。過多的自由基和NO也會引起腦神經細胞膜脂質過氧化損傷，而影響膜通透性及離子轉運，觸發Ca2+內流；腦細胞內Ca2+超載，進一步干擾線粒體氧化磷酸化過程，以至能量產生進一步障礙;并引起中性蛋白酶活性的病理性增加，可使細胞膜結構分解，神經元骨架破壞導致細胞死亡[3]。

丹參紅花提取物由植物丹參、紅花提取而得，其主要成分有丹參素、丹參酮、紅花甙、新紅花甙等主要成分。近年來在臨床上有了廣泛應用，主要用于抗心絞痛和冠心病的治療。本實驗利用D-gal誘導小鼠衰老模型，采用Y型迷宮和跳臺檢測學習記憶功能，結果發現模型對照組小鼠跳臺錯誤次數和迷宮錯誤次數明顯增多，MDA含量非常顯著增高，SOD活力顯著降低。提示用D-gal誘導小鼠的衰老模型成功。而丹參紅花提取物能明顯降低跳臺錯誤次數和迷宮測試潛伏期，能明顯提高SOD的活力，呈現一定的量效關系，這表明丹參紅花提取物具有提高學習記憶能力，延緩衰老的作用。其機理可能與其清除體內自由基，提高機體抗氧化能力有關，此方面與報道的丹參紅花提取物保護內皮細胞抗氧化作用機理相一致[4]。本研究為丹參紅花提取物在臨床上的進一步應用提供了實驗依據。

[1]周 松，陳 騰，王青莉.丹參注射液的藥理作用及臨床應用綜述[J].中國藥師，2008，27(8):805-808.

[2]Sohal RS.Role of oxidative stress and protein oxidation on the aging process[J].Fress Radic Biol Med，2002，33(1):37-44.

[3]Song X,Bao M,Li D,et al.Advanced glycationin D-galactose induced mouse aging model[J].Mechanism of Aging and Development，1999，108(3):239-251.

[4]滿 永，丁 莉，郭漢幫，等.丹參紅花提取物保護內皮細胞免受氧化損傷的體外實驗[J].中國臨床康復，2006，10(39)：119.