RAEBT型骨髓增生異常綜合征患者白血病相關融合基因分析（附病例報告）

吳強強，王冬青，郝紅峰，岳 青，王桂臣，孫黎飛

骨髓增生異常綜合征 （myelodysplastic syndrome，MDS）是一組由于造血干細胞異質性克隆導致的疾病。MDS臨床表現較為復雜，通常表現為外周血一系至三系降低，骨髓增生異常，并伴有造血細胞病態造血，其最終發展結局并不一致，其中約30%～60%的患者經過數月或數年后可以轉變為白血病。按照不同病程情況MDS分為不同型別，筆者所在醫院血液腫瘤科收治了1例MDS-RAEBT患者，為了進一步觀察和監測患者的病情發展情況，筆者檢測并分析了其骨髓細胞中白血病相關融合基因的表達情況。

1 對象和方法

1.1 病例資料 患者，男，51歲，因原因不明發熱入院。體格檢查：體溫37.3°C，脈搏110次/min，呼吸18次/min，血壓115/75 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。 血液分析：WBC 4.7×109/L，Hb 67 g/L，HCT 0.19%，MCV1 00 fL，PLT 44×109/L。為查明貧血原因行骨髓檢查，細胞學結果顯示增生極度活躍伴原始粒系和淋巴細胞過多，初步診斷為MDS-RAEBT粒淋混合細胞型，轉入血液科繼續進行治療。

1.2 材料和試劑 檢測材料為患者骨髓穿刺時取得的骨髓標本。主要檢測試劑包括RNA提取試劑盒和反轉錄試劑盒（天根生物技術公司），白血病融合基因檢測試劑盒（思爾成生物技術公司）等。

1.3 骨髓細胞學分析 抽出患者骨髓及時制備涂片標本，標本經瑞氏-吉氏染色，鏡檢觀察并分析骨髓細胞特征。另選骨髓涂片做過氧化酶POX染色，通過鏡檢觀察細胞質中過氧化酶的表達情況分析骨髓細胞類型。

1.4 白血病相關融合基因的檢測 為確定患者骨髓中可能存在的分子遺傳學變異情況，筆者應用多重巢式逆轉錄PCR方法檢測了目前已知的融合基因的表達情況。

1.4.1 骨髓細胞mRNA的提取與反轉錄 RNA的提取步驟按照試劑盒標準步驟進行，將患者骨髓標本，置于紅細胞裂解液中裂解紅細胞，離心除去上清，得到的白細胞沉淀用細胞裂解液裂解、過濾柱過濾后收集濾液，DEPC乙醇沉淀RNA，吸附柱吸附RAN沉淀，經過去蛋白、脫DNA等純化步驟后，得到骨髓細胞 RNA。取 10ulRNA經逆轉錄后得cDNA，以cDNA為模板擴增并電泳檢測白血病相關融合基因的表達情況，包括AML1-ETO、BCR-ABL、CBF-MYH、E2A-PBX、MLL-AF4、PML-RARα、SIL-TAL、TEL-AML等8類白血病相關基因及其41種亞型。

1.4.2 多重巢式PCR檢測融合基因 以逆轉錄得到的cDNA為模板，按照標準步驟進行擴增檢測融合基因。第一輪反應條件為：95℃ 5min；95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 2min，共30個循環；4℃保存。第二輪反應條件為：95℃ 5 min；95℃30 s，58℃ 30 s，72℃ 2 min，共30個循環；72℃ 5 min產物充分延伸；4℃保存。取擴增產物10 μl上樣，2%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后紫外檢測儀檢測結果。

2 結 果

2.1 患者的骨髓細胞學特征 結合外周血片顯微鏡分析患者骨髓細胞特征，結果顯示骨髓增生極度活躍，并且伴原始幼稚粒系和幼稚淋巴細胞過多，血小板少見，可診斷為MDS-RAEBT粒淋混合細胞型，圖1示骨髓涂片中的幼稚粒系與幼稚淋巴細胞，分別可占片中骨髓細胞總數的26%與24%。

圖1 患者骨髓細胞涂片（10×100）

POX染色結果顯示幼淋巴細胞呈陰性表達，粒系細胞呈現強陽性表達，細胞胞漿中充滿粗大的藍黑色顆粒（圖2）。

圖2 過氧化物酶染色（10×40）

對骨髓中白血病融合基因的檢測結果發現在AML1-ETO泳道有熒光信號，提示患者骨髓細胞中染色體斷裂形成的AML-ETO易位基因呈陽性，圖3箭頭所示，圖3示從左向右的融合基因依次為TEL-AML、SIL-TAL、PML-RARα、MLL-AF4、E2A-PBX、CBF-MYH、AML1-ETO和BCR-ABL。

圖3 融合基因的RT-PCR檢測電泳圖

3 討 論

MDS的確切病因及其分子機制尚不明確，其誘因多樣，生物、化學或物理等因素均可引起染色體異常導致基因突變，從而使某個惡變的細胞克隆性增生，也可能只引起基因表達的改變導致MDS。由于MDS臨床表現較為復雜，而其向白血病轉化的過程中分子遺傳學改變的機制可能更為復雜。

研究發現在不同類型的白血病中存在不同的分子標記物。在急性髓細胞白血病（AML）中存在特異性遺傳標志為8號與21號染色體的長臂在二區二帶斷裂并相互易位 [t（8；21）（q22；q22）]，AML1基因重排可作為診斷AML的分子標志[1,2]。t（8；21）（q22；q22）使21號染色體上的AML1基因與8號染色體上的ETO基因發生融合，形成AML1-ETO融合基因，產生一種嵌合蛋白，作為主要的抑制物改變了正常AML1-CBF（核結合因子）β這種與造血干細胞分化有關的轉錄復合物的生理功能[3,4]，同時在AML中還發現原始細胞CD34抗原表達率及表達強度均高于正常的原始細胞[5]。此外研究還顯示，AML1-ETO易位基因見于10%的原發性AML，在M2型中的陽性率可達50%，其中M2b中甚至達到90%。AML1-ETO陽性的細胞有一定程度的分化能力，并且對化療反應較為敏感，大劑量阿糖胞苷治療效果較好，具有較高的緩解率，預后較好，無病生存期長[3]。

國內有學者研究分析了AML1-ETO陽性病例骨髓涂片,檢測到骨髓涂片中的異形中幼粒細胞與AML1-ETO基因陽性表達存在關聯[6]。也有學者發現兒童AML患者AML1-ETO融合基因陽性不能提示形態學是否可診斷為M2b，AML1-ETO融合基因對兒童M2b沒有成人特異[7]。新近的研究還發現AML1-ETO融合基因與白血病TSC基因的轉錄激活有關[8]。

關于MDS和白血病關系，已有的研究提示部分MDS最終可能會惡性轉化為白血病。本文患者骨髓細胞分析顯示MDS-RAEBT粒淋混合細胞型，但是卻表現為AML-ETO融合基因陽性。由于染色體易位導致的AML-ETO融合基因目前認為是AML的分子標記物，這提示了在MDS的轉化過程中已經發生染色體易位，導致了基因組不穩定并產生異質性細胞，提示可能在MDS向白血病轉化的過程中，骨髓細胞由于某些因素作用使得染色體發生斷裂與重接，原來染色體上的正常功能基因發生改變，產生基因突變，形成了新的融合基因，而攜帶該突變基因的骨髓細胞克隆產生不正確的效應分子，與后期的白血病發生密切相關，并使得發生白血病轉化的可能性大大增加。

對于AML型白血病，盡管存在局限性，但AML1-ETO融合基因仍然是目前發現的可靠的檢測標記物，AML1-ETO融合基因在正常人體細胞中不存在，因而也可以作為白血病微小殘留病檢測的基礎。雖然目前對于MDS以及白血病的研究已經取得了較大的進展，但是對于MDS與白血病的進展關系、分子水平的發病機制以及高效可靠的分子診斷標記物的研究仍然需要更多的實驗證據。越來越多的研究證實現階段在臨床檢驗中，對于MDS患者進行融合基因的篩查對于指導疾病的診斷、治療和預后具有重要的意義[9,10]。

[1]Mcormack E,Bruserud O,Gjertsen BT.Review:genetic models of acute myeloid leukaemia[J].Oncogene,2008,27（27）:3765-79.

[2]Tabe Y.Molecular diagnosis of and molecular targeting therapy for leukemia[J].Rinsho Byori,2009,57（2）:137-45.

[3]Nguyen S,Leblanc T,Fenaux P,et al.A white blood cell index as the main prognostic factor in t（8;21）acute myeloid leukemia（AML）:a survey of 161 cases from the French AML intergroup[J].Blood,2002,99:3517-3523.

[4]Elagib KE,Goldfarb AN.Oncogenic pathways of AML1-ETO in acute myeloid leukemia:multifaceted manipulation of marrow maturation[J].Cancer Lett,2007,251（2）:179-86.

[5]Porwit-MacDonald A,Janossy G,Ivory K,et al.Leukemiaassociated changes identified by quantitative flow cytometry.Ⅳ.CD34 over expression in acute myelogenous leukemia M2 with t（8;21）[J].Blood,1996,87:1162-1169.

[6]王 平，彭賢貴，陳幸華，等.AML1/ETO＋融合基因陽性的AML患者骨髓細胞形態學分析[J].重慶醫學，2010,39（12）:57-63.

[7]鞏文玉，趙 瑋，李志剛，等.攜帶AML1/ETO+融合基因兒童急性髓細胞白血病患者骨髓細胞形態學特點[J].中華檢驗醫學雜志，2006,29（1）:121-123.

[8]Xu ZF,Wang L,Wang Y,et al.The effects of AML1B and AML1/ETO on the transactivation of TSC genes[J].Zhonghua Xue Ye Xue Za Zhi,2009,30（12）:804-7.

[9]譚齊賢.臨床血液學和血液檢驗[M].北京:人民衛生出版社，2003.206-209.

[10]劉旭輝，王云貴，梁 毅，等.急性髓系白血病AML1-ETO融合基因檢測及其臨床意義[J].現代實用醫學，2005，17（3）:106.