藥物對細胞自噬性死亡的干預作用*

邢國勝，賀桂泉，趙文君

(1.天津市天津醫院，天津 300211； 2.天津市體北醫院，天津 300060)

細胞自噬性死亡(autophagic cell death)源于希臘語，意為自體吞噬(self-eating)，簡稱自噬(autophagy)，是區別于細胞凋亡(apoptosis)的另一種細胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)形式[1]。近年來，隨著分子生物學和基因組學等實驗方法的快速發展和日臻完善，尤其是酵母自噬突變株的產生，使細胞自噬性死亡的分子基礎研究有了很大的進展，盡管藥物與細胞自噬性死亡關系的研究尚處于探索階段，但已逐步成為一個新的研究熱點，受到各領域學者的廣泛關注。通過研究藥理作用不同的各類藥物對細胞自噬性死亡的影響，可能會對許多疾病，包括心肌缺血/再灌注(ischemia-reperfusion，I/R)損傷、神經退行性疾病、腫瘤、感染等的發病機制和防治策略提出新的觀點。本文對近年藥物干預不同類型細胞自噬性死亡的研究進展進行概述。

1 細胞自噬性死亡的分類及檢測方法

細胞自噬性死亡首見于1962年，通過電子顯微鏡觀察到其起始于細胞質內半環狀雙層或多層膜結構的自噬泡的形成，進而包繞大量細胞質和線粒體、內質網等細胞器，形成自噬體(autophagosome)，然后與溶酶體融合，成為自噬溶酶體(autolysosome)，最終通過溶酶體內的蛋白酶降解其內成分，所有這些過程均在同一細胞中完成[2]。目前細胞自噬性死亡一般分為三類：巨自噬或稱大自噬(macroautophagy)、微自噬或稱小自噬(microautophagy)及分子伴侶介導的自噬(chaperone-mediated autophagy,CMA)[3]。巨自噬即通常所指的自噬主要負責降解細胞內穩定并永久存在的蛋白質，產生氨基酸以維持細胞在缺乏營養時的生存。微自噬包繞底物的是自身發生內陷的溶酶體膜，并斷裂成小液泡以便在內腔中消化。CMA的底物都是可溶的蛋白質分子，在清除蛋白質時有選擇性，而前兩者無明顯的選擇性[4]。

細胞自噬性死亡的檢測方法目前大致分為形態學方法、免疫染色方法及分子生物學技術。如同研究細胞凋亡時觀察凋亡小體的存在，用形態學方法研究細胞自噬性死亡最直接的證據就是利用電子顯微鏡觀察雙層膜的自噬體及其內容物，在透射電鏡下可見到線粒體的腫脹變性，其周圍出現空泡狀雙層膜樣結構，然后雙層膜環繞成自噬體，進而與溶酶體融合，消化，也可見自噬溶酶體內最終不能降解的殘體等，該方法目前被認為是檢測自噬體的金標準。通過計算自噬體的面積或體積占整個細胞的總面積或總體積的比例，還可以對自噬性細胞死亡進行定量檢測，但受實驗方法的局限性，往往達不到很精確的程度[5]。免疫染色方法可直接觀察到參與自噬體膜形成的哺乳動物自噬標記蛋白Beclin 1和微管相關蛋白1的輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,MAP1-LC3)蛋白的表達，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡等儀器還可對相關標志物進行定量或半定量測定。其中，自噬體膜標志性蛋白質的檢測是通過對自噬體膜上存在的Apg12/Apg5結合體和LC3等標志性蛋白質的檢測來定量檢測自噬，而胞質型(I型)和膜型(II型)LC3的比例及LC3-II的含量則代表著自噬體的程度與數量[6]。另外，還可利用LC3與磷脂酰乙醇胺即腦磷脂(phosphatidyl ethanolamine,cephalin,PE)結合的形式(LC3-PE)存在于自噬體形成各階段的內、外膜及自噬溶酶體膜上的特點來間接定量檢測自噬，即通過與綠色熒光蛋白 ( green fluorescent protein,GFP)結合成Apg12-Apg5-GFP和LC3-GFP來實現對自噬體的檢測[7]。單丹(磺)酰戊二胺(monodansylcadaverine,MDC)染色法則是一種可在分子水平分析自噬發生機制的特異性檢測方法，自噬體形成所依賴的第二個泛素樣結合系統(Apg8)是位于自噬囊泡膜上與MDC特異結合的生化標志，通過熒光染色，MDC可被細胞吸收并選擇性地聚集于自噬囊泡，在熒光顯微鏡下可見核周區域陽性顯色，呈點狀結構，故可利用這種方法對自噬進行定量檢測[8]。自噬溶酶體及其不能降解產物(殘體)的檢測也是一種間接自噬體檢測法，自噬體和溶酶體融合后，可利用吖啶橙作為非極性反膠態分子團的分子探針，當自噬溶酶體內酸性磷酸酶活性增強時會顯著著色，對殘體的檢測則主要是對脂褐素顆粒的顯微觀察。近年來，許多學者還利用GFP-LC3轉基因動物研究自噬，也有學者利用細胞培養轉染技術和Beclin 1基因敲除等分子生物學方法進行研究[9]。

2 藥物對細胞自噬性死亡的影響

2.1內皮抑素(endostatin) 腫瘤內的血管是新生的，腫瘤可通過這些新生的血管實現腫瘤間質的血管化，并在腫瘤的生長和擴散中起重要的作用。近年來，抑制腫瘤新生血管生成已成為抗腫瘤藥的新靶點。腫瘤內出現血管后，除了血管帶給瘤細胞營養外，內皮細胞本身對瘤細胞也有旁分泌刺激作用。腫瘤新生血管的旁分泌效應源于內皮細胞產生的生長因子和細胞因子，其可刺激腫瘤細胞生長和轉移。內皮抑素為內源性血管細胞增殖的強效生成抑制劑，既往研究顯示其可通過特異性抑制內皮細胞增殖和遷移、黏附過程，阻止血管生成而發揮抗腫瘤作用。近年研究證實，用內皮抑素誘導人內皮細胞株EAhy 926的死亡主要是自噬性的死亡。電鏡下觀察內皮抑素作用于人內皮細胞6，24 h后就可見大量的自噬泡。內皮抑素產生的細胞毒作用不依賴于caspase途徑和氧化途徑，但可被3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)和亮肽素，抑酞酶(絲氨酸，半胱氨酸溶酶體蛋白抑制劑)所調控[10]。

2.2環孢素A(cyclosporine A，CsA) 環孢素A是目前臨床上最常用的化療藥物之一，其不僅是化療藥物的增敏劑，而且可以直接抑制多種腫瘤細胞的生長，導致非典型的細胞凋亡[11]。隨著自噬研究的廣泛開展，有研究表明，環孢素A可以增強膠質瘤細胞的自噬性死亡，通過Western印跡法檢測發現，2 μmol/L濃度的環孢素A可以上調三氧化二砷誘導的的膠質瘤細胞U87-MG 表達Beclin-1，明顯高于環孢素A和三氧化二砷單獨對照組，LC3-II蛋白也明顯增加(P<0.05)?？梢姡┝凯h孢素A可增加三氧化二砷誘導的細胞自噬性死亡，使其C50由單獨作用時的4.28 μmol/L降低至1.28 μmol/L[12]。

2.3丙戊酸(valproic acid，VPA) 丙戊酸是經典的廣譜抗癲癇藥物，為組蛋白去乙酰化酶抑制藥(histone deacetylase inhibitors,HDACIs)，具有一定的腫瘤生長抑制作用，可以通過半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)、p21WAF1等多種信號轉導途徑和基因誘導使U937、Jurkat clone E6-1(Jurkat)和BALL-1等腫瘤細胞發生凋亡，其可能成為一種有潛力的抗腫瘤治療新藥物[13-15]。深入研究發現，丙戊酸在誘導細胞凋亡的基礎上，對多種腫瘤細胞的自噬也具有不同程度的誘導作用。經0.25、0.50、1.00、2.00、5.00和10.0 mmol/L丙戊酸處理的人腦膠質瘤細胞系U87、T98G和SF295的細胞用透射電子顯微鏡、熒光測定儀和Westem blotting方法觀察超微結構、自噬水平及細胞內LC3-II、Beclin-1、p-Akt和p-p70S6K等蛋白質的表達水平，通過透射電子顯微鏡可見經2.50 mmol/L丙戊酸處理96 h后，人腦膠質瘤細胞系U87細胞胞質內有大量自噬體和自噬溶酶體，0.50、1.00、2.00和5.00 mmol/L丙戊酸處理后，MDC熒光強度均明顯強于對照組(P<0.05)，其自噬水平隨丙戊酸濃度的升高而逐漸增強；經丙戊酸處理后，人腦膠質瘤細胞系U87細胞自噬相關蛋白LC3-II和Beclin-l表達水平明顯升高，而p-Akt和p-p70S6K表達水平明顯降低。因此，丙戊酸可誘導膠質瘤細胞發生自噬，其誘導膠質瘤細胞發生自噬的機制可能與阻斷Akt信號轉導通路有關[16]。

2.4碳酸鋰(lithium carbonate) 碳酸鋰臨床常用于癲狂癥的治療，具有情緒控制的作用，對躁狂和抑郁交替發作的雙相情感性精神障礙有很好的治療和預防復發的作用，對反復發作的抑郁癥也有預防發作作用，可用于治療分裂-情感性精神病。近年研究發現，碳酸鋰具有降低突變蛋白的聚集和細胞死亡率的作用，并可誘發哺乳動物的細胞自噬。對于神經細胞株PC12，強力霉素能夠穩定地誘導huntingtin polyQ突變體(HDQ74)的產生，用碳酸鋰處理后可有效地清除可溶性HDQ74，并減少HDQ74和α-synucleins的聚集，這種作用可被3-MA所抑制；在清除HDQ74和α-synucleins過程中，細胞自噬的特征蛋白質II型LC-3的含量明顯增加，通過熒光檢測發現LC-3成囊泡狀分布?？梢姡妓徜嚳赏ㄟ^細胞自噬清除HDQ74和α-synucleins。另外，碳酸鋰通過抑制肌醇-磷酸酶(inositolmonophosphatase，IMPase)活性引起肌醇(myoinositol)和三磷酸肌醇(inositol triphosphate，IP3)的減少，誘發細胞自噬性死亡，而加入肌醇和脯氨酰內肽酶抑制劑(proyl endopeptidase inhibitor，PEI)后，IP3的含量提高，其引起細胞自噬的作用也被同時減弱，進一步說明碳酸鋰鹽誘發細胞自噬性死亡的作用主要由IP3的含量來調控。碳酸鋰通過抑制IMPase來誘發細胞自噬性死亡的作用并不依賴于對mTOR的抑制，提示這可能是一個新的作用途徑[17]。

氨茶堿(aminophylline) 氨茶堿用于治療支氣管哮喘已有50多年的歷史，近年來發現氨茶堿除了具有支氣管舒張作用外，還具有抗炎和免疫調節等作用，而后者很可能是氨茶堿治療哮喘的重要的機制。T淋巴細胞是肌體免疫調控的主要組成成分，其死亡方式對人體免疫狀態有重要影響。分別予小鼠1、5、25和125 mg/kg氨茶堿10 d后，觀察通過流式細胞儀檢測分離出的脾T淋巴細胞的自噬及凋亡變化，發現各濃度氨茶堿組T淋巴細胞自噬率與陰性對照組比較均明顯下降(P<0.05)。氨茶堿體內干預后，可誘導小鼠脾T淋巴細胞自噬率下降，凋亡率增加，提示此藥可能通過T淋巴細胞的不同程序性死亡方式來調節肌體免疫功能[18]。值得注意的是，氨茶堿在體外卻增加外周血T淋巴細胞的自噬率。同樣使用流式細胞儀檢測經氨茶堿、地塞米松干預培養的健康人外周血T淋巴細胞的自噬和凋亡現象，發現10-5～10-3mol/L的氨茶堿干預T淋巴細胞培養72 h后，體外培養的T淋巴細胞自噬率變化呈劑量依賴性，自噬率與陰性對照組比較均有顯著性差異(P<0.05)，各濃度組的自噬率和凋亡率之間均無相關性(P>0.05)；按不同細胞密度接種T淋巴細胞，10-5mol/L氨茶堿干預0、24、48和72 h后發現，隨著細胞密度的減少和時間的延長，其自噬率有增加趨勢，但無顯著性差異。此結果說明10-5～10-3mol/L氨茶堿可誘導人外周血T淋巴細胞自噬率增加，而自噬與凋亡間可能相互獨立[19]。氨茶堿對細胞自噬性死亡干預的體內和體外不一致性的相關機理研究尚未見文獻報道。

2.6曲格列酮(troglitazone,Trog) 曲格列酮是過氧化酶體增殖激活受體(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR gamma,PPAR)的配體之一，是該類配體中第一個用于臨床治療II型糖尿病的藥物，由于其肝臟毒性大，僅上市3年就被美國FDA撤出了臨床。盡管如此，曲格列酮在某些領域仍具有一定的研究價值，相關的實驗研究從未中斷。利用電鏡對經25 mol/L Trog處理后的HeLa細胞(人宮頸癌上皮細胞株)進行觀察發現，Trog能夠誘導HeLa細胞自噬活動的增加，刺激8 h后細胞內的自噬體明顯增加；HeLa細胞轉染GFP-LC3后，用Trog刺激4 h，熒光顯微鏡下觀察GFP-LC3的點狀顯色數顯示相對于對照細胞，Trog明顯增加細胞自噬體的數量(P<0.01)；免疫雜交結果則顯示該藥能增加自噬相關基因LC3的表達，并于刺激后4 h達到高峰[20]。這為同類藥物的進一步開發及臨床應用提供了極有價值的結果。

2.7阿托伐他汀(atorvastatin) 他汀類藥是廣泛應用于臨床的一種調脂藥，除調脂作用外，還有很多有益的心血管保護作用，被稱為他汀類藥的多效性，其中最突出的作用是改善血管內皮功能，但其改善內皮功能的機制尚未完全闡明。近年，有學者通過不同時相使用阿托伐他汀對血管內皮細胞自噬的影響，從細胞學方面探討其可能機制。用Hank’s液替代培養基進行饑餓誘導血管內皮細胞發生自噬的模型，在誘導自噬前和誘導過程中使細胞分別與含或不含阿托伐他汀的正常培養基或Hank’s液共孵育，用透射電鏡檢測空白對照組、誘導前和誘導中都應用阿托伐他汀組,以及僅在誘導中應用阿托伐他汀組和僅在誘導前應用阿托伐他汀組細胞發生自噬的情況。結果各組細胞均出現典型的自噬細胞形態學改變，與對照組相比，誘導前和誘導中都應用阿托伐他汀組和僅在誘導中應用阿托伐他汀組的自噬泡占胞質總面積的比值均明顯降低(P<0.01)；誘導前應用阿托伐他汀組的該比值低于對照組；誘導前和誘導中都應用阿托伐他汀組的該比值低于僅在誘導中應用阿托伐他汀組?？梢姡⑼蟹ニ】梢种蒲軆绕ぜ毎淖泽w吞噬，這一作用可能與阿托伐他汀改善血管內皮功能的機制有關[21]。

2.8維生素D類似物EB1089 多年來，維生素D的抗腫瘤作用備受關注，但嚴重的高鈣血癥副作用影響了其在臨床中的應用。于是，國內、外學者合成并研究了一些維生素D類似物，其中，EB1089為代表藥物，其既有很強的抗腫瘤活性，又能明顯減輕高鈣血癥的發生。EB1089對體外培養的所有類型的腫瘤細胞幾乎均有抑制或促分化作用，其抗腫瘤作用機制主要是誘導抗腫瘤細胞周期阻滯、促進腫瘤細胞分化及誘導腫瘤細胞凋亡。用EB1089處理人乳腺癌細胞時，可引起細胞G1期阻滯，S期細胞數目下降，從而使G0/G1期細胞堆積；還可誘導處于G1/G2期的白血病細胞向成熟階段分化，阻遏細胞進入S期；另外，EB1089還能抑制乳腺癌細胞和結腸癌細胞的生長[22]。近年國外學者通過對EB1089的深入研究發現，其誘導的多種細胞死亡均與細胞自噬相關，MCF-7細胞死亡時雖不依賴于caspase，但也能引起染色質凝聚和DNA斷裂。熒光顯微鏡下觀察MDC染色發現，約40%經EB1089處理的MCF-7細胞呈強陽性。而EB1089干預共轉染了紅色熒光蛋白DsRed1和LC3-β與組蛋白2β-GFP融合蛋白的MCF-7細胞后，紅染細胞增加了約20%；干預1～4 d后，LC3-β陽性細胞開始增加；其誘導的細胞死亡可被3-MA所抑制。EB1089的這種啟動核凋亡的作用中包括了依賴Beclin 1的自噬途徑[23]。

3 結語與展望

自噬性死亡對細胞的存活與死亡都有作用，是把雙刃劍，但其具體機制還有待研究。藥物干預細胞發生自噬性死亡與藥物的種類、細胞的類型、藥物的濃度和藥物作用細胞的時間等多種因素有關。由于自噬的特點，藥物誘導細胞產生自噬性細胞死亡后會出現兩種不同的結果：一種是保護細胞防止周圍環境帶來的損害；另一種是啟動細胞主動性的Ⅱ型細胞死亡程序。目前，對于這兩種不同結果的產生還沒有發現特定的規律。找到靶向作用于自噬性細胞死亡分子機制的藥物對于多種疾病的分子治療具有重要的意義。通過藥物誘導某些對肌體有害的細胞如腫瘤細胞產生自噬，繼而引起細胞死亡，對治療某些嚴重影響人類生存的疾病將會起到積極作用。另外，通過研究藥物對自噬性死亡相關基因表達的調控，對于尋找治療腫瘤、病原體感染與免疫、神經變性疾病和線粒體性肌病等疾病的有效措施具有重要意義，并為藥物基因組學的發展奠定基礎。

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