宮頸鱗癌患者人乳頭瘤病毒感染和治療后轉歸情況分析

王 潔，曹海霞，馬 蓉，王 卓，吳建中

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，發病率和死亡率一直居高不下。據統計，每年約有50萬新發病例，其中80%發生在發展中國家。我國宮頸癌患病率和死亡率均約占世界的1/3，每年新增宮頸癌患者13.15萬，約有5萬例死于宮頸癌。大量研究證實，人乳頭瘤病毒(human papillom avirus，HPV)與宮頸癌變的發生密切相關，持續性高危型HPV感染是發展為宮頸癌的必然因素[1]。目前，已發現的HPV基因亞型有100多種，其中超過1/3可以特異性感染肛門生殖器，并且具有地域差異性，在不同國家和地區HPV感染率和亞型分布不同[2]。了解宮頸癌患者HPV不同亞型的分布特點有助于為宮頸病變的預防提供重要依據，也為HPV疫苗的研發和臨床使用奠定了基礎。本研究采用實時熒光PCR技術對228例確診宮頸鱗癌患者進行高危型HPV檢測，探討高危型HPV感染與宮頸鱗癌的關系及亞型分布特點。同時，對其中59例患者進行跟蹤隨訪，分析不同治療方案對HPV感染轉歸的影響,從而為宮頸癌治療提供一定的理論依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2010年10月—2011年6月在我院住院治療并經病理檢查確診為宮頸鱗癌患者228例，年齡24～79歲。將患者分為6個年齡組，其中<30歲6例，30～39歲27例，40～49歲79例，50～59歲66例，60～69歲35例，≥70歲15例。所有患者治療前均進行HPV基因分型檢測。隨訪患者于治療后1個月和3個月時分別再次進行HPV基因分型檢測。

1.2 標本收集和DNA抽提

1.2.1 標本收集 用無菌生理棉球洗去宮頸外分泌物，將棉拭子伸入宮頸管內鱗狀上皮交界處采樣，旋轉3～4圈，停留數秒，以取得宮頸分泌物或脫落細胞。將取樣后的棉拭子放入加有專用細胞保存液的取樣管中，充分漂洗。每份標本取1 mL待檢，余-20℃凍存。

1.2.2 DNA抽提 將1 mL待檢標本置1.5 mL離心管中，1 000 rpm離心5 min，棄上清，PBS洗滌2遍，采用試劑盒抽提患者宮頸脫落細胞DNA(QIAamp DNA Mini Kit/QIAamp Blood Kit，QIAGEN，Germany)，操作方法按試劑盒說明書進行。

1.3 HPV基因分型定量檢測

1.3.1 HPV基因分型和擴增 采用雙通道實時熒光定量PCR檢測方法，同時對HPV16、18、45、31、33、52、58、67型DNA進行分型定量。操作方法按照試劑盒說明書(Realquality RQ-HPV HR,AB ANALITICA,Italy)進行。

1.3.2 PCR擴增條件 將混合好的PCR反應液在ABI-7300熒光定量PCR儀上進行基因擴增檢測，95℃預變性3 min后，以94℃變性15 s,57℃延伸40 s擴增40個循環。根據標準品建立標準曲線，由ABI-7300系統軟件自動計算待測樣品中HPV DNA拷貝含量。

1.4 治療方法[3]

1.4.1 化療 選用PVB化療方案，采用深靜脈插管化療，予DDP 60～80 mg d1靜脈滴注，VCR 1 mg d1靜推，BLM 15 mg d1肌肉注射，3～4周重復，共2～4個療程。根據患者的耐受性，決定化療的療程數。

1.4.2 放射治療 予15 MV X線或60Co盆腔前后野垂直外照射，盆腔中線平面劑量DT 45～50 Gy，常規分割放療1.8～2 Gy/次，部分患者給2/3量后予中擋鉛盆腔四野照射。后裝采用192Ir selectron 后裝治療機，A 點6～7 Gy/周，總量25～35 Gy。對于宮旁侵犯嚴重、病灶消退不滿意者，局部縮野劑量增加6～8 Gy。

1.5 統計學分析

采用卡方檢驗進行統計學分析，應用SPSS 17.0軟件進行數據處理，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染陽性率

228例宮頸鱗癌患者中HPV感染者共200例，HPV總陽性率為87.7%。其中HPV16陽性150例，占65.8%，HPV33/52/58/67陽性59例，占25.9%，HPV18/45陽性20例，占8.8%，HPV31陽性14例，占6.1%。各年齡組患者HPV陽性率分別為：<30歲83.3%(5/6)，30～39歲77.8%(21/27)，40～49歲89.9%(71/79)，50～59歲93.9%(62/66)，60～69歲82.9%(29/35)，≥70歲80.0%(12/15)，差異無統計學意義(P=0.238，見表1)。

表1 HPV主要基因型感染與年齡分布

2.2 各年齡組HPV16陽性率

150例HPV16陽性患者中，<30歲5例，30～39歲19例，40～49歲57例，50～59歲42例，60～69歲23例，≥70歲4例。各年齡組HPV16陽性率分別為：<30歲83.3%(5/6)，30～39歲70.4%(19/27)，40～49歲72.2%(57/79)，50～59歲63.6%(42/66)，60～69歲65.7%(23/35)，≥70歲26.7%(4/15)，差異有統計學意義(P=0.030，見表1)。

2.3 各年齡組HPV33/52/58/67陽性率

HPV33/52/58/67次要高危型陽性患者共59例，其中<30歲1例，30～39歲4例，40～49歲12例，50～59歲11例，60～69歲19例，≥70歲12例。各年齡組HPV33/52/58/67陽性率分別為：<30歲16.7%(1/6)，30～39歲14.8%(4/27)，40～49歲15.2%(12/79)，50～59歲16.7%(11/66)，60～69歲54.3%(19/35)，≥70歲80.0%(12/15)，差異有統計學意義(P=0.000，見表1)。

2.4 治療后HPV感染的轉歸

在59例獲隨訪的HPV陽性患者中有24例(40.7%)治療后1個月轉陰，41例(69.5%)治療后3個月轉陰。將患者按照治療方法分為2組，其中放化療聯合治療組31例，單純放療組28例。患者治療后1個月HPV感染轉陰人數分別為：放化療聯合組14例，占45.2%，單純放療組10例，占35.7%。治療后3個月HPV感染轉陰人數增加，分別為：放化療聯合組24例，占77.4%，單純放療組17例，占60.7%。在放化療聯合治療組中共有7例患者HPV感染未轉陰，其中4例病毒載量下降，2例同時感染HPV16和HPV33/52/58/67，前者病毒載量下降，后者病毒載量上升；1例感染HPV16，治療后病毒載量上升。在單純放療組中有11例HPV感染未轉陰，其中5例病毒載量下降，3例同時感染HPV16和HPV33/52/58/67，前者病毒載量下降或轉陰，后者病毒載量上升；1例治療前同時感染HPV16和HPV31，治療后HPV16和HPV31病毒感染轉陰，但HPV33/52/58/67轉陽；1例感染HPV16和HPV33/52/58/67，治療后前者病毒載量上升，后者病毒載量下降；1例治療前僅感染HPV16，治療后HPV16病毒載量下降，HPV33/52/58/67轉陽。

3 討論

HPV是一種嗜上皮性雙鏈環狀DNA病毒，在人和動物中分布廣泛，能夠特異性感染皮膚和黏膜。流行病學研究表明，HPV感染與宮頸病變密切相關，根據病毒致病性差異分為低危型HPV(LR-HPV，包括6,11、 40、42、 43、 44、54、61、70、72、51 型)和高危型HPV(HR-HPV，包括16、18、31、33、35、39、43、51、52、56、59、68、73、82 型)。LR-HPV主要引起尖銳濕疣和宮頸上皮內瘤變，而HR-HPV的持續感染被認為是宮頸癌發生的重要原因。

本研究選取了228例宮頸鱗癌患者，采用實時熒光定量PCR法進行基因分型檢測。結果表明HPV總陽性率為87.7%，其中HPV16占65.8%，HPV33/52/58/67占25.9%，HPV18/45占8.8%，HPV31占6.1%，提示宮頸鱗癌與HPV感染密切相關，且大部分與HPV16亞型有關，與國外文獻報道一致[4-5]。實驗中HPV次要高危型33/52/58/67陽性患者明顯多于HPV18/45亞型患者，與部分文獻報道有悖，我們認為此為HPV亞型分布的人群差異性和地區特異性導致。將患者分為6個年齡組分別探討不同年齡段患者HPV感染情況和亞型分布，發現HPV感染陽性率在各年齡段之間無差異(P>0.05),提示HPV感染是各年齡段宮頸癌患者共同的致病因素。當分別研究患者HPV16和HPV33/52/58/67陽性率時，我們發現各年齡組間差異顯著，具有統計學意義。HPV16陽性患者大都為70歲以下，70歲以上患者中僅26.7%(4/15)為陽性。相反，HPV次要高危型33/52/58/67感染則易見于高齡患者中，60歲以上患者中此亞型陽性率顯著增加，在70歲以上患者中高達80.0%(12/15)。結果提示在宮頸鱗癌患者中HPV亞型分布可能與年齡相關。由于本研究資料樣本數偏少，特別是30歲以下和70歲以上年齡組，因此還需進一步研究證實。

在對59例隨訪患者研究中我們發現40.7%的HPV感染陽性患者治療后1個月轉陰，69.5%的HPV感染陽性患者治療后3個月轉陰，提示HPV對宮頸癌治療敏感，在隨訪中具有一定意義。本院既往研究認為，對中晚期宮頸癌行PVB或PF方案同步放化療可提高患者生存率，因此我們根據治療方法將隨訪患者分為放化療聯合組及單純放療組，探討不同治療方案對HPV感染轉歸的影響。結果表明患者治療后1個月HPV感染轉陰人數分別為放化療聯合組14例，占45.2%；單純放療組10例，占35.7%。治療后3個月HPV感染轉陰人數分別為：放化療聯合組24例，占77.4%；單純放療組17例，占60.7%。統計學分析兩者差異無統計學意義(P>0.05)。我們考慮與樣本量和隨訪時間有關，增加樣本數量，延長隨訪時間有利于進一步研究。在HPV感染未轉陰的18例患者中有9例表現為病毒載量的下降，提示治療有效果。另外9例病毒載量不同程度上升，其中8例為多重感染，最常見的是HPV16合并HPV33/52/58/67感染，說明多重感染可能影響了治療效果，且與宮頸癌的不良預后有關[6]。

自WHO于1992年宣布HPV是引起宮頸癌變的首要因素以來,宮頸癌已成為了目前唯一病因明確的腫瘤。近年來，隨著HPV檢測技術的不斷提高和人們對HPV在宮頸癌中作用的不斷探討，高危型HPV的感染逐漸成為了宮頸癌早期診斷和預后判斷的重要指標之一。我們的研究進一步證實了高危型HPV感染與宮頸癌變有關，同時還表明在高齡患者中更易出現HPV次要高危型33/52/58/67感染陽性，提示HPV亞型分布存在年齡差異性，為HPV疫苗的研發和應用奠定基礎。此外，在對隨訪患者HPV檢測中我們認為宮頸癌的不同治療方法對于HPV感染的轉歸也可能存在一定影響，多重感染有可能與宮頸癌的療效預后相關。雖然目前尚無明顯證據證明不同HPV亞型之間的相互作用會加強宮頸癌的病理作用,但多重感染在疾病進程中依舊是一個重要的宿主因素，有可能成為一個獨立的預后指標，提示在宮頸疾病的治療中應高度重視多重感染的發生。

[1]Cutts FT,Franceschi S,Goldie S,et al.Human papillomavirus and HPV vaccines [J].Bulletin of the World Health Organization,2007,85(9):719-726.

[2]Clifford GM,Smith JS,Plummer M,et al.Human papillomavirus types in invasive cervical cancer worldwide: a meta analysis[J].Br J Cancer,2003,88(1):63-73.

[3]黃健,葉勁軍,陸諤梅.化療和放療聯合治療中晚期宮頸癌療效分析[J].癌癥進展雜志,2008,6(2):181-184.

[4]Bulk S,Berkhof J,Bulkmans NW,et al.Preferential risk of HPV16 for squamous cell carcinoma and ofHPV18 for adenocaicinoma of the cervix compared to women with normal cytology in the Northern lands[J].Br J Cancer,2006,94(1):171-175.

[5]Castle PE,Solomon D,Schiffman M,et al.Human papillomavirus type 16 infections and 2-year absolute risk of cervical precancer in women with equivocal or mild cytologic abnormalities[J].J Natl Cancer Inst,2005,97(14):1066-1071.

[6]Munagala R,Donà MG,Rai SN,et al.Significance of multiple HPV infection in cervical cancer patients and its impact on treatment response[J].Int J Oncol,2009,34(1):263-271.