TDGF-1基因下調對人鼻咽癌細胞生長遷移侵襲的影響

沈 榮，龔丹丹，范 鈺

畸胎瘤衍生生長因子-1(teratocarcinoma-derived growth factor-1，TDGF-1)基因是一種自分泌型的腫瘤生長因子，是表皮生長因子家族重要成員之一，該基因定位于人類染色體3p21.3[1]，編碼Cripto蛋白。有研究發現，TDGF-1基因在許多惡性實體瘤如乳腺癌、結腸癌、胃癌、胰腺癌、陰莖癌、膀胱癌及前列腺癌等中均呈過度表達，而其在正常組織中都不表達或低表達[2-3]，TDGF-1基因與大腸癌、乳腺癌的侵襲有關[4-7]。但目前在國內關于該基因在人鼻咽癌中作用的研究甚少[8]。為此，本研究借助于RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術，以化學合成的TDGF-1基因小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉染處理人鼻咽癌CNE-2細胞，觀察TDGF-1 基因siRNA轉染對癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人鼻咽癌CNE-2細胞，購自美國ATCC公司。TDGF-1基因siRNA正義鏈為5′- UUCGGCCUCGGUCUUCCCATT-3′，反義鏈為5′- UGGGAAGACCGAGGCCGAATT-3′。TDGF-1抗體購自美國Santa Cruz公司。TRIzol、RNase inhibitor、逆轉錄酶SSRTⅡ、Taq酶和轉染試劑LipofectamineTM2000均購自美國Invitrogen公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養及轉染處理

人鼻咽癌CNE-2細胞在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液(Gibco公司)、37℃、5%CO2、飽和濕度環境的條件下連續培養。轉染前1天，將1.0×105對數期生長的細胞接種于24孔培養板，1mL/well，培養過夜。次日進行轉染。基本操作按說明書進行。細胞分組：(1)空白對照組(Con-A)為未經任何處理的鼻咽癌細胞；(2)空載對照組(Con-B)為即脂質體對照組；(3)siRNA組為10%胎牛血清的L-15培養液中含不同濃度(3.125、6.25、12.5 nmol/L)的已用LipofectamineTM2000包埋的siRNA。轉染后于不同時間采用胰酶消化收取細胞，再進行以下試驗。

1.2.2 鼻咽癌細胞TDGF-1基因檢測

1.2.2.1 mRNA水平 采用熒光實時定量PCR檢測。收集細胞，以TRIzol抽提細胞總RNA,取總RNA 1 μg，以oligo dT(15 mer)為引物逆轉錄合成cDNA第一鏈，以此cDNA鏈2 μL為模板進行PCR擴增，步驟參照說明書進行。TDGF-1定量PCR引物為上游：5′-CAATTCGGCCTCGGTCTTC-3′；下游：5′-TTCAGGCAGCAGGTTCTGTTT-3′。FAM探針：5′-CATGGGTGCCCCGACGTTGC-3′ -TAM RA。以3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)為內參。PCR反應條件為：95℃，預變性3 min，95℃，30 s；52℃，45 s；72℃，45 s；35 個循環后，72℃再延伸7 min。

1.2.2.2 蛋白水平 參照文獻[9]的方法，采用蛋白質印跡法方法檢測。提取對照組和各實驗組細胞總蛋白，蛋白定量后進行常規蛋白質印跡法檢測,將硝酸纖維素膜進行掃描或拍照。利用Kodak Digital Science 1D Image Analysis Software (Eastman Kodak Company,USA) 測定條帶凈灰度值，與內參照β-actin的測定結果相比較，并計算比值。

1.2.2.3 軟瓊脂集落形成試驗 參照文獻[10]的方法，進行軟瓊脂集落培養試驗，觀察TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌細胞錨著不依賴性增殖的影響。

1.2.2.4 體外癌細胞遷移試驗 采用劃痕試驗檢測癌細胞的遷移能力。將所有細胞接種于6孔板，以含10%胎牛血清的L-15培養液培養至細胞將近長滿，換無血清L-15培養液培養24 h后，以1 mL移液器吸頭在細胞層仔細劃痕，以PBS洗兩遍，去除細胞碎片，更換含10%胎牛血清的L-15培養基繼續培養20 h，倒置顯微鏡下對劃痕前后的相應區域拍照。設3復孔，重復3次。

1.2.2.5 體外癌細胞侵襲試驗 根據文獻[10]的方法，以Boyden小室模型方法檢測癌細胞侵襲能力。400倍光鏡下計數穿過聚碳酸酯膜的細胞數，以侵襲細胞的相對數目表示腫瘤細胞侵襲能力。隨機計數5個視野內的細胞數，取平均值進行統計處理，每組計數3份樣本。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 siRNA敲除對鼻咽癌細胞TDGF-1基因的影響

采用TDGF-1 siRNA轉染鼻咽癌CNE-2細胞后，分別采用熒光實時定量PCR和蛋白質印跡法檢測TDGF-1基因mRNA和蛋白水平。結果顯示，與Con-A組細胞比較，siRNA組TDGF-1 mRNA和蛋白水平明顯降低，且呈時間和濃度依賴性(mRNA：均P<0.005；蛋白：均P<0.005)；而Con-B組與Con-A組細胞比較，TDGF-1 mRNA和蛋白水平并無明顯差異(均P>0.05)。(見圖1、2)。

圖1 TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌CNE-2細胞TDGF-1mRNA水平的影響(注：Con-A與Con-B曲線重疊)

圖2 TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌CNE-2細胞TDGF-1蛋白水平的影響

2.2 TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌細胞軟瓊脂集落形成的影響

軟瓊脂集落形成試驗結果發現，鼻咽癌CNE-2細胞在體外半固體培養體系中可以自發地形成集落，而經TDGF-1 siRNA轉染的細胞集落生長呈劑量依賴性減少(r=-0.891，P<0.005)。見圖3。

2.3 TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌細胞遷移的影響

采用劃痕試驗評測TDGF-1 siRNA轉染對癌細胞遷移能力的影響。結果顯示，TDGF-1 siRNA轉染組遷移距離明顯低于對照組，且呈濃度依賴性(r=-0.836，P<0.005)。見圖4。

2.4 TDGF-1 siRNA對鼻咽癌細胞侵襲的影響

Boyden小室上室細胞穿過膜上matrigel到膜的下室面，其數量反映了細胞侵襲能力的大小。收集TDGF-1 siRNA轉染48 h的細胞，采用Boyden小室檢測癌細胞侵襲情況。結果發現，與對照組比較，siRNA組穿過濾膜的細胞數明顯下降，且呈濃度依賴性(r=-0.889，P<0.005)。見圖5。

圖3 TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌細胞錨著不依賴性增殖的影響

圖5 TDGF-1 siRNA轉染對鼻咽癌CNE-2細胞體外侵襲的影響

3 討論

近年來，在基因研究領域中，RNAi和siRNA已得到較廣泛應用。RNAi是一種調節mRNA的生物學現象，能夠使基因的mRNA被相應的雙鏈RNA分子敲除，其效果要遠強于正義和反義RNA[11]。RNAi最主要的功能在于可以調節和關閉基因的表達，進而調控細胞的各種高級生命活動。而siRNA是指RNAi過程中在細胞內產生的長約21～25核苷酸(nt)的小雙鏈RNA分子，是RNAi作用機制的重要中間效應分子，目前，已經有人工化學合成的siRNA，具有明顯的敲除相應基因mRNA的效果[12]。

為了解TDGF-1基因在鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲中的作用，我們根據TDGF-1基因mRNA特點，設計了siRNA序列，并用化學方法合成，轉染鼻咽癌CNE-2細胞后，分別采用熒光實時定量PCR和蛋白質印跡法方法檢測TDGF-1 基因mRNA和蛋白水平。結果顯示，轉染組細胞TDGF-1基因mRNA和蛋白水平明顯下降。接著，我們進一步在體外觀察了TDGF-1 基因下調對鼻咽癌CNE-2細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

正常真核細胞，除成熟血細胞外，大多須粘附于特定的細胞外基質上才能抑制凋亡而存活，即稱為錨著依賴性(anchorage dependence)。癌細胞可以錨著不依賴性狀態生長。癌細胞在軟瓊脂形成集落的多少與惡性程度呈正相關。癌細胞侵襲能力強，則在軟瓊脂上形成的集落數目多。軟瓊脂集落培養試驗結果顯示，經TDGF-1 siRNA轉染處理的鼻咽癌CNE-2細胞軟瓊脂集落數明顯減少，且呈濃度依賴性(P<0.005)。

癌細胞遠處轉移過程中，遷移和侵襲是重要步驟。本研究分別采用劃痕試驗和Boyden小室模型檢測癌細胞遷移和侵襲能力。結果顯示，轉染組鼻咽癌細胞遷移和侵襲細胞數明顯減少，且呈濃度依賴性。提示TDGF-1下調可抑制鼻咽癌細胞的遷移和侵襲能力。

鼻咽癌細胞遷移、侵襲是一個復雜的過程，機制十分復雜，涉及到許多基因的變化。到目前為止，尚不清楚有哪些基因參與了TDGF-1基因調控鼻咽癌細胞侵襲轉移的過程，有必要借助于基因芯片技術進一步探索其中的分子機制。

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