Survivin、COX-2與膽管癌的血管生成

歐陽波，張有成，黃 強

近年來的大量研究表明，Survivin和COX-2在多種腫瘤組織中過表達，通過抑制腫瘤細胞凋亡、影響腫瘤血管生成等機制參與腫瘤的發生和發展，但Survivin和COX-2是否通過影響腫瘤血管形成來影響膽管癌的生物學行為尚未清楚。為此我們采用免疫組織化學技術檢測Survivin、環氧合酶-2(COX-2)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)和CD34在膽管癌組織和正常膽管組織中的表達，并探討他們與臨床病理特征的關系及Survivin、COX-2表達與VEGF表達及微血管密度(microvessel density，MVD)的相關性，為膽管癌的抗血管治療提供一個新的途徑和理論依據。

1 材料與方法

1.1 標本采集 選取安徽省立醫院2005年3月—2008年2月手術切除膽管癌標本32例，其中男17例，女15例，年齡43～79歲，平均年齡60.3歲，術前均未行放化療等抗腫瘤治療，所有標本均經病理證實，另選正常膽管組織9例為對照組。所有標本均用10%甲醛固定，石蠟包埋，每個蠟塊行4 mm厚連續切片。

1.2 主要試劑 鼠抗人Survivin單克隆抗體，鼠抗人COX-2單克隆抗體，鼠抗人VEGF單克隆抗體，鼠抗人CD34單克隆抗體，PV6000試劑盒、濃縮型二甲基聯苯胺(DAB)試劑盒均為北京中杉生物技術有限公司產品。

1.3 檢測方法 用免疫組織化學SP二步法。將已知陽性的結腸癌切片作為陽性對照，用磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline,PBS)代替一抗作為陰性對照。實驗步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定 (1) CD34陽性判斷及MVD計數：采用Weidner法，抗CD34單抗表達于血管內皮細胞胞質或胞膜，任何染色成棕黃色的單個細胞或細胞團，不管其是否形成管腔，只要與周圍的微血管、腫瘤組織和其他連接組織有清楚的分離，都認為是一個可記數的微血管。每一標本先于低倍鏡(×100)下選3個微血管數最多的區域，然后在高倍鏡(×400)下記數每一個區域中5個血管最高密度區的微血管數，取均值代表MVD值。(2) VEGF、COX-2與Survivin的結果判斷：VEGF陽性表達為每張切片中看到有大于5%的腫瘤細胞胞質或胞膜出現棕黃色顆粒；COX-2陽性表達為每張切片中看到有大于5%的腫瘤細胞胞質出現棕黃色顆粒；Survivin陽性表達為每張切片中看到有大于5%的腫瘤細胞胞質出現棕黃色顆粒。

2 結果

2.1 膽管癌組和正常膽管組中MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達 具體見表1。

表1 膽管癌組與對照組MVD、VEGF和Survivin表達比較

注：與對照組相比，at=13.36，P<0.01；bχ2=6.35，P<0.05；cχ2=11.96，P<0.05；dχ2=14.88，P<0.01

在膽管癌組織中檢測到VEGF(圖1)、COX-2(圖2)、CD34(圖3)和Survivin(圖4)的表達；而在正常膽管組中無Survivin表達，只有1例COX-2微弱表達，MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達在兩組中差異有顯著性意義。

圖1 膽管癌中VEGF陽性表達 (SP染色，×400)

圖2 膽管癌中COX-2陽性表達 (SP染色，×400)

圖3 膽管癌中CD34陽性表達(SP染色，×400)

圖4 膽管癌中Survivin陽性表達(SP染色，×400)

2.2 膽管癌組織MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達與臨床病理資料的關系 膽管癌組織MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的大小、分化無關；而有轉移者則較無轉移者均顯著增高。見表2。

2.3 膽管癌組織MVD與VEGF的表達的相關性 在32例膽管癌病例中，VEGF陽性表達的有21例，其平均MVD為62.97，VEGF表達陰性的平均MVD為34.06，兩組比較t=9.35P<0.01，說明VEGF的表達與MVD相關。

2.4 Survivin、COX-2與MVD、VEGF表達的相關性 Survivin陽性表達的病例有23例，其中20例VEGF表達陽性(87.0%)，在Survivin表達陰性的9例中，只有1例VEGF表達陽性(11.1%)，兩組比較χ2=13.31，P<0.01，表明VEGF表達與Survivin表達密切相關；在23例Survivin陽性表達的膽管癌中，MVD平均數為60.94，明顯高于Survivin陰性表達的9例(MVD平均數為32.82)，兩組比較t=8.31，P<0.01；Survivin與VEGF共陽性表達的有20例，其MVD平均數為63.86，明顯高于共陰性表達的8例(MVD平均數為31.28)，兩組比較t=11.13，P<0.01。COX-2陽性表達的病例有25例，其中20例VEGF表達陽性，在COX-2表達陰性的7例中，只有1例VEGF表達陽性，兩組比較χ2=7.76，P<0.01，表明VEGF表達與COX-2表達密切相關；在25例COX-2陽性表達的病例中，其MVD平均數為58.95，明顯高于COX-2陰性表達的7例(MVD平均數為31.89)，兩組比較t=6.89 ，P<0.01；COX-2與VEGF共陽性表達病例有20例，其MVD平均數為63.78，明顯高于共陰性表達的6例(MVD平均數為29.42)，兩組比較t=11.96,P<0.05。

表2 MVD、VEGF、Survivin和COX-2的表達與膽管癌臨床病理特征的關系

注：與對照組相比，at=6.55，P<0.01；bχ2=16.67，P<0.05；cχ2=4.17，P<0.05；dχ2=2.99，P>0.05

3 討論

1971年，Folkman首先提出腫瘤生長和轉移有血管依賴性。大量研究證實腫瘤生長、侵襲和轉移依賴于新生血管的形成，阻斷血管生成是抑制腫瘤生長的有效策略，由此產生了抗血管生成治療腫瘤的設想。隨著人們對腫瘤血管生成機制更為廣泛深入的研究，針對腫瘤血管生成分子機制所設計的抗血管生成策略，成為腫瘤治療研究的新熱點。膽管癌是膽道常見的惡性腫瘤，既往認為膽管癌是一種血管分布相對較少的腫瘤，但隨著對膽管癌形成分子機制研究的深入，血管生成在膽管癌發生發展中的重要性已逐步受到重視。

VEGF是迄今鑒定出來的最重要的血管生成因子，與腫瘤血管新生密切相關，并與腫瘤的轉移、預后有關[1]。MVD不僅與腫瘤細胞的營養和供氧有關，還是一個有意義的預測性指標[2]。本實驗顯示在膽管癌組中的VEGF表達和MVD平均值顯著高于正常膽管組織，提示血管新生在膽管癌的發展過程中同樣起重要作用，且VEGF、MVD與膽管癌轉移關系密切，由此推測VEGF、MVD可能與膽管癌的轉移和預后相關。

Survivin是一種結構獨特的凋亡蛋白抑制因子家族的成員，特異地表達于人和鼠的胚胎發育組織以及多數人類腫瘤細胞。研究表明，Survivin在細胞凋亡和細胞周期的基因調控中發揮重要作用，使其成為一個非常有吸引力的癌癥治療靶點；我們前期的研究發現Survivin基因參與了膽管癌細胞增殖和凋亡過程[3]，本實驗結果顯示在膽管癌中Survivin基因的表達與轉移相關，但與患者的性別、年齡及腫瘤的大小、分化等無關。

血管形成過程的核心是內皮細胞的分裂增殖，確切地說，取決于血管內皮細胞的生存和凋亡平衡的結果，有研究證實在腫瘤血管生成過程中內皮細胞中表達的VEGF可誘導和促進Survivin的高表達，而高表達的Survivin抑制了各種指向caspases的凋亡機制，從而保護內皮細胞逃避凋亡[4]。相反，Survivin表達缺乏可導致內皮細胞及新生毛細血管的退化。研究顯示向內皮細胞中導入靶向Survivin的反義寡核苷酸，結果VEGF的促內皮細胞功能受到抑制，從而促進腫瘤內皮細胞凋亡，抑制腫瘤血管的新生，最后導致腫瘤生長受到抑制，達到治療腫瘤的目的[4-5]。可見，VEGF促進了Survivin的表達，而同時高表達的Survivin又維持和保護了VEGF的促內皮細胞功能，從而促進了腫瘤血管生成和浸潤轉移。由此推測：VEGF的表達上調可能直接或間接地參與Survivin的基因轉錄、蛋白合成的調控，及其蛋白功能活化的過程，從而增加Survivin的積累；而Survivin的過度表達，使G2/M期點失控，細胞失去了正常增殖周期中凋亡開關的限制，可促使腫瘤細胞惡性轉化和增殖凋亡平衡失調，還可能作為腫瘤血管生成的調控因子參與腫瘤血管生成。本實驗結果顯示Survivin與VEGF、MVD在膽管癌中的表達具有正相關性，Survivin與VEGF共陽性表達比共陰性表達癌組織中的MVD顯著增高，說明Survivin與VEGF、MVD之間的關系密切及Survivin與VEGF在促血管形成方面有協同作用。

環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2) 是前列腺素生物合成的限速酶，大量研究表明COX-2表達增強與多種腫瘤的發生發展有關，COX-2上調可能是腫瘤發生過程中一個重要的限速步驟，COX-2可能通過促進腫瘤細胞增殖和抑制細胞凋亡、促進腫瘤惡性轉化、促進腫瘤血管生成等機制參與腫瘤的發生發展[6]。COX-2不僅在多種腫瘤中過表達，而且在原發或轉移腫瘤的新生血管內皮細胞中高表達。敲除COX-2基因的實驗動物腫瘤組織血管密度下降，腫瘤生長明顯減慢，提示COX-2與腫瘤血管生成關系密切。研究發現，COX-2可誘導VEGF和bFGF等促血管生成因子表達，并可通過基質金屬蛋白酶(MMPs)和Integrins促腫瘤血管生成。我們前期的研究發現COX-2基因參與了膽管癌細胞增殖和凋亡過程[7]。本實驗結果顯示，COX-2在膽管癌中高度表達，而在正常膽管組中只有1例微弱表達，提示COX-2可能對膽管癌的發生發展起重要作用，但COX-2的表達與患者的性別、年齡以及腫瘤的大小、分化及是否轉移無關；實驗結果還顯示COX-2與VEGF、MVD在膽管癌中的表達具有正相關性，COX-2與VEGF共呈陽性表達比共呈陰性表達癌組織中的MVD顯著增高(P<0.01)，我們認為COX-2表達和膽管癌血管生成有關，而VEGF可能是COX-2誘導膽管癌血管生成的重要介質，COX-2與VEGF、MVD之間的密切關系及COX-2與VEGF在促血管生成方面有協同作用。

鑒于血管生成在腫瘤發生發展及血行轉移中的特殊作用，COX-2、Survivin和VEGF可能通過影響腫瘤血管生成在膽管癌轉移等惡性行為中發揮著重要作用。但是，膽管癌的發生是一個極其復雜的過程，是多基因協同作用、多因素共同參與、綜合發展的結果，COX-2、Survivin不僅可以參與膽管癌細胞的增殖和凋亡過程，而且可促進血管的生成，但其過表達只是其中的一種形式，深入研究COX-2、Survivin及其在膽管癌發生發展中的作用，有可能從另一方面揭示膽管癌的發病機制，使得靶向COX-2、Survivin的抗腫瘤治療具有廣泛的應用前景，并為膽管癌的臨床診治開辟一條新的途徑，延緩膽管癌復發和轉移，提高膽管癌的療效。

[1]Martins SF,Reis RM,Rodrigues AM,et al.Role of endoglin and VEGF family expression in colorectal cancer prognosis and anti-angiogenic therapies[J].World J Clin Oncol,2011,2(6):272-280.

[2]Zhou D,Cheng SQ,Ji HF,et al.Evaluation of protein pigment epithelium-derived factor (PEDF) and microvessel density (MVD) as prognostic indicators in breast cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol,2010,136(11):1719-1727.

[3]歐陽波,黃強,王志華.Survivin、血管內皮生長因子及微血管密度在正常膽管組織和膽管癌組織中的比較[J].中國組織工程研究與臨床康復,2007,11(19):3802-3804.

[4]O’Connor DS,Schechner JS,Adida C,et al.Control of apoptosis during angiogenesis by survivin expression in endothelial cells[J].Am J Pathol,2000,156(2):393-398.

[5]Mesri M,Morales-Ruiz M,Ackermann EJ,et al.Suppression of vascular endothelial growth factor-mediated endothelial cell protection by survivin targeting[J].Am Pathol,2001,l58(5):1757-1765.

[6]Sirica AE,Lai GH,Endo K,et al.Cyclooxygenase-2 and ERBB-2 in cholangiocarcinoma: potential therapeutic targets[J].Semin Liver Dis,2002,22(3):303-313.

[7]歐陽波,黃強,王志華.COX-2在膽管癌中的表達及其與血管生成的關系[J].肝膽外科雜志,2006,14(6):432-435.