低氧誘導因子-1基因在宮頸癌組織中的表達及意義

劉紅娥 辜為為

低氧誘導因子-1基因在宮頸癌組織中的表達及意義

劉紅娥 辜為為

目的研究HIF-1在宮頸癌組織、正常宮頸組織及宮頸良性病變組織中的表達，并與宮頸癌患者年齡、淋巴結轉移與否、臨床分期進行比較，探討其與宮頸癌侵襲/轉移的關系。方法應用逆轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)的方法檢測56例宮頸癌組織、正常宮頸組織及20例宮頸良性病變組織中HIF-1 mRNA的表達情況，并應用相關統計學方法進行分析。結果HIF-1 mRNA在宮頸癌組織、正常宮頸組織及宮頸良性病變組織中的表達率分別為62.50%、41.07%、35.00%，宮頸癌與正常宮頸組織(P=0.023)、宮頸癌與宮頸良性病變組織(P=0.001)間的HIF-1αmRNA表達率差異有統計學意義，而正常宮頸組織與宮頸良性病變組織之間的HIF-1αmRNA表達率差異無統計學意義(P=0.091)。HIF-1 mRNA在不同臨床分期(P=0.001)及淋巴結轉移(P=0.002)中的表達率存在顯著差異，但在不同年齡患者的癌組織中HIF-1 mRNA的表達率無差異(P＞0.05)。結論HIF-1 mRNA在宮頸癌中的表達率明顯高于正常宮頸組織及宮頸良性病變組織。HIF-1與宮頸癌臨床分期密切相關，臨床分期越晚，其腫瘤組織中HIF-1 mRNA的表達率越高。伴淋巴結轉移宮頸癌HIF-1 mRNA表達率高于無淋巴結轉移者。HIF-1 mRNA表達率與患者年齡無關。

宮頸癌;低氧誘導因子-1;逆轉錄聚合酶鏈式反應

宮頸癌侵襲轉移是導致宮頸癌患者死亡的最主要原因。有研究提示低氧誘導因子-1(hypoxia induciblefactor-1，HIF-1)在惡性腫瘤的侵襲轉移過程中扮演著十分重要的角色。本研究對HIF-1 mRNA在宮頸癌組織、正常宮頸組織及宮頸良性病變組織中的表達進行檢測，并與宮頸癌患者年齡、淋巴結轉移與否、臨床分期進行比較，探討其與宮頸癌侵襲轉移的關系。

1 材料與方法

1.1 標本來源 標本均來自我院2005年4月至2008年10月期間住院手術切除的宮頸癌、正常宮頸組織及宮頸良性病變組織共132例。其中宮頸良性病變組織20例(宮頸糜爛12例、宮頸息肉4例、宮頸肥大4例)、乳腺癌組織(病理證實為鱗狀細胞浸潤癌及宮頸腺癌)及正常宮頸組織(因子宮肌瘤行子宮全切患者)各56例。根據2000年國際婦產科聯盟(FIGO)宮頸癌分期，0期6例，Ⅰ期31例，II 14例，Ⅲ期5例;伴淋巴結轉移36例，無淋巴結轉移20例;全部患者術前均未行任何抗癌治療。所有患者均為女性，宮頸癌患者平均年齡47歲(19～78歲);宮頸良性病變患者平均年齡32歲(22～41歲)。

1.2 RNA提取 按Trizol試劑盒說明書提取組織總RNA:取100 mg凍存的組織標本，加入lml Trizol試劑研磨至漿液，室溫靜置5 min。加入0.2 ml氯仿快速劇烈搖15 s，室溫靜置2～3 min，于4℃12000 r/min離心15 min。將上層移至另一EP管中，加入0.2 ml異丙醇和0.2 mlRNA沉淀液，輕柔混勻，室溫靜置10 min，4℃離心12000 r/min離心10 min，棄上清。用冰冷的75%乙醇lml洗RNA沉淀1～2次，于4℃7500r/min離心 5 min;棄上清，室溫涼干5～10 min，溶于40μlDEPC水中。RNA的定量與鑒定，取2 μl RNA用DEPC處理水稀釋250倍，混勻后用大型多功能分光光度計測其260 nm、280 nm處的吸光值，計算A260/A280比值及RNA含量。RNA樣本用瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.3 逆轉錄反應 在20 μl的反應體系中加入5×reaction buffer4 μl，oligo(dT)18 Primer(0.5 μg/μl)1 μl，RiboLock TM Ribonuclease inhibitor(20 U/μl)1 μl，10 mM dNTP 2 μl，總RNA2 μg，逆轉錄酶 M-MLV1 μl，DEPC 水補齊至 20 μl，42℃孵育60 min(逆轉錄)，72℃孵育10 min以終止反應，于冰上降溫(滅活逆轉錄酶)。

1.4 PCR反應 擴增HIF-1基因的引物序列，上游引物:AGAAACCACCTATGACCTGC，下游引物:GTCGTGCTGAATAATACCACTC，擴增產物長度410bp，β-actin為內參照，上游引物:CAACTTCATCCACGTTCACC，下 游 引 物:GAAGAGCCAAGGACAGGTAC，擴增產物長度268bp。25μl的反應體積中加入 cDNA2 μl，LOX 上、下游引物各 1μl，PCR Master Mix12.5μl，去離子水8.5μl混勻后，置于 PCR 儀中，反應條件:95℃預變性10 min 后，95℃30 s，61℃30 s，72℃30 s，40 個循環，最后72℃ 延伸10 min。

1.5 PCR產物鑒定 用1.0%瓊脂糖凝膠將提取的RNA進行電泳，在紫外線燈下觀察。

1.6 統計分析 計數資料采用χ2檢驗及四表格確切概率法，采用SPSS 13.0軟件進行統計學處理。

2 結果

2.1 HIF-1 mRNA在宮頸癌、正常宮頸組織及宮頸良性病變組織中的表達 HIF-1 mRNA在宮頸癌組織中的表達率為62.50%，而在正常宮頸組織和宮頸良性病變組織中的表達率分別為41.07%、35.00%(圖1、圖2、圖3)。經統計學分析，宮頸癌與正常宮頸組織(P=0.023)、宮頸癌與宮頸良性病變組織(P=0.001)間的HIF-1 mRNA表達率差異有統計學意義，而正常宮頸組織與宮頸良性病變組織之間的HIF-1 mRNA表達率差異無統計學意義(P=0.091)。見表1。

2.2 HIF-1 mRNA與臨床病理特征的關系 0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌 HIF-1 mRNA表達率分別為 50.00%、41.93%、100.00%、100.00%，統計學分析，Ⅱ、Ⅲ期乳腺癌HIF-1 mRNA的表達率明顯高于0、Ⅰ期(P=0.001);伴淋巴結轉移宮頸癌HIF-1 mRNA表達率為77.77%，明顯高于無淋巴結轉移的35.00%(P=0.002);在19～50歲、＞50歲的患者中，HIF-1 mRNA的表達率分別為60.00%、66.66%，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表2。

表1 HIF-1 mRNA在宮頸癌、正常宮頸組織及良性病變組織中的表達

表2 HIF-1 mRNA與臨床病理特征的關系

3 討論

HIF-l基因定位于人類染色體14q21-q24，屬于bHLH-pas蛋白家族，由120kD的α亞基(HIF-1α)和91/93/94kD的β亞基(HIF-1β)組成。HIF-1α是唯一的氧調節亞單位，通過泛素、蛋白酶體途徑降解，缺氧降低泛素化或通過突變阻斷泛素化而增加HIF-1α的表達［1］。缺氧條件下，由于降解通路被阻斷，HIF-1α迅速與HIF-1β聚合形成有活性的HIF-1二聚體，通過激活其下游靶基因的轉錄實現其生理學效應［2］。HIF-l與靶基因中的HIF-1結合點結合，促進其轉錄，引起一系列細胞對缺氧的反應［3］。HIF-1在腫瘤中的生物學功能有促進糖酵解;促進新生血管生成;參與腫瘤細胞的增殖、誘導腫瘤細胞的凋亡;參與紅細胞生成及鐵代謝［4］。

在本研究中，HIF-1 mRNA在正常宮頸組織及宮頸良性病變組織的表達率分別為41.07%、35.00%，且差異均無統計學意義，提示HIF在宮頸良性病變的發生中作用并不十分明顯。而在宮頸癌中HIFmRNA高達58.92%，高于正常宮頸組織及良性病變組織，表明HIF-1的過度表達與宮頸癌的發生有關。HIF-1在不同臨床分期患者中的表達不完全相同，Ⅱ期、Ⅲ期宮頸癌患者癌組織中的表達率較0期、Ⅰ期患者升高。該實驗結果反映出HIF-1 mRNA表達的變化趨勢，即隨著宮頸癌病情的進展，HIF-1 mRNA的表達率呈上升趨勢。在伴有淋巴結轉移的患者中HIF-1 mRNA的表達率明顯高于無淋巴結轉移患者，提示HIF可能與宮頸癌發生淋巴結轉移有關。目前公認腫瘤組織中氧含量的降低是促進腫瘤轉移的主要原因之一，這也可能是HIF-1參與腫瘤侵襲轉移的主要原因［5］。而HIF-1 mRNA在不同年齡組的宮頸癌患者中的表達率在統計學上無顯著差異(P＞0.05)，表明HIF-1與患者年齡無關。

以上研究表明HIF-1 mRNA在宮頸癌中的表達率明顯高于正常宮頸組織及宮頸良性病變組織。HIF-1 mRNA與宮頸癌臨床分期密切相關，臨床分期越晚，其腫瘤組織中HIF-1 mRNA的表達率越高。伴淋巴結轉移宮頸癌HIF-1 mRNA表達率高于無淋巴結轉移者。HIF-1 mRNA表達率與患者年齡無關。

［1］Post DE，van Meir EG.A novel hypoxia-inducible factor(HIF)activated oncolytic adenovirus for cancer therapy. Oncogene，2003，22:2065-2072.

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Expression of Hypoxia induciblefactor-1 Gene in cervical cancer and its clinical significance

Objective To study the expression of HIF-1 in human cervical cancer and explore the relationship between HIF-1expression and clinical pathological features(patient’s age，limph node metastasis，clinical stage，).MethodsThe expression of HIF-1 mRNA in 56 cases of human cervical cancer tissues，normal cervical tissues and 20 cases of cervical benign lesion tissues was detected by reverse transcriptase polymerase chainreaction(RT-PCR).ResultsThe expression rate of HIF-1 mRNA in cervical cancer，normal cervical tissues and cervical benign lesion tissue were 62.50%、41.07%、35.00% ，statistical difference was found among cervical carcinoma group，normal cervical tissues group and benign lesion group.The expression of HIF-1 mRNA were associated with clinical stage(P=0.001)and lymph node metastasis(P=0.002)，but had no correlation with age and tumor size(P＞0.05).ConclusionHIF-1 mRNA expression is increased in cervical cancer tumor tissues compared with normal tissues and cervical benign lesion tissue，HIF-1 is relevant with the occurrence of cervical cancer.The cervical cancer cells proliferation capacity is increase，degree of malignancy is higher and facilitates metastasis occurred which HIF-1 is expressed.

Cervical cancer，HIF-1，RT-PCR

510730廣州開發區醫院婦產科