RASSF1B基因的克隆及序列分析

陳吉祥,陳明軍,張尤歷

(江蘇大學附屬醫院,江蘇鎮江 212001)

近年來的研究發現,人染色體 3p21.3等位缺失與多種腫瘤的發生有關[1],該位點存在腫瘤抑制基因 RASSF1基因家族[2,3]。該家族至少包含 7種不同的轉錄本(轉錄本A～G)。RASSF1B基因在腫瘤組織和正常組織中都有表達,但其功能尚沒有明確[4]。本研究采用 RT-PCR結合生物信息學方法對胃癌、肝癌等腫瘤細胞中的 RASSF1B基因進行了克隆及序列分析。

1 材料與方法

1.1 材料 5株腫瘤細胞分別為胃腺癌細胞 AGS、肝癌細胞 HEPG2、高轉移肺癌細胞 95D、肺腺癌細胞LTEP-a-2、白血病細胞U937。MMLV反轉錄試劑盒等。

1.2 細胞培養 將上述 5種腫瘤細胞分別加DMEM及 10%小牛血清,置 CO2培養箱中 37℃培養至細胞均勻覆蓋細胞瓶約 3/4。

1.3 RNA的提取、擴增及克隆 以 Trizol提取上述各種細胞的總RNA并純化,用MMLV反轉錄得到cDNA。利用DNAstar軟件設計 RASSF1B基因的特異引物,擴增引物為 5′-ATG AGC TTG AAC AAG GAC GG-3′(上游引物)、5′-TCC ACC TGG GGG TAC AAGAGG-3′(下游引物),擴增長度為 591 bp。以人β-actin作內參照,引物序列為 5′-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3′(上游引物)、5′-GGC GTA CAG GTC TTT GCG GAT G-3′(下游引物),擴增長度為 512 bp。PCR反應條件:95℃、2 min,94℃、15 s,58℃、30 s,72℃、1.5 min,30個循環,72℃、10 min。以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR產物。將RASSF1B的 PCR產物連接到 T-載體上,轉化到大腸桿菌DH5α中,經藍白斑篩選出陽性克隆。

1.4 RASSF1B基因的序列分析 應用生物信息學軟件分析。

2 結果

分別提取了 5株腫瘤細胞的總 RNA。凝膠電泳結果顯示,28 S和 18 S條帶較為明顯,RNA的完整性和質量較好。核酸檢測儀檢測顯示A260/A280均在 1.9～2.0,與電泳結果一致。

經RT-PCR擴增后,RASSF1B在 5種腫瘤細胞中均有表達,其中在肺腺癌細胞株LTEP-a-2和白血病細胞株 U937中的表達量較高,在其他三種腫瘤細胞中的表達量較少。肺腺癌細胞株LTEP-a-2、白血病細胞株U937、胃腺癌細胞株 AGS、高轉移肺癌細胞株 95 D、肝癌細胞株 HEPG2的 RASSF1B mRNA相對表達量分別為 0.62、0.71、0.07、0.22、0.13。

將RASSF1B的 PCR產物連接到 T-載體上,轉化到大腸桿菌DH5α中,經藍白斑篩選出陽性克隆。測序結果表明克隆后的基因全長為 591 bp,其中編碼區為 570 bp,編碼 189個氨基酸,與網上登錄RASSF1B一致 (Genbank序列號:NM_170712)。應用生物學軟件 ExPASy Proteomics Server對其進行分析,結果顯示,RASSF1B基因含有一個 Ras結合區域(45～139 aa)和一個 SARAH區域 (143～189 aa)。

3 討論

RASSF1家族是近年來發現的,目前的研究表明,其不同的轉錄剪切本在惡性腫瘤的發生和誘導細胞凋亡過程中發揮重要作用,它們能夠直接參與細胞周期的調控。但其作用機理尚未明確。

有研究表明,在一些基因家族中,各轉錄本之間存在協調表達,一旦表達平衡被打破,就會導致細胞不正常增殖[5]。因此,在不同的細胞系中分析各轉錄本表達比例的變化可以初步推斷各轉錄本與腫瘤發生間的關系。由于RASSF1家族的轉錄本A在正常和癌變的組織中表達差異明顯,故研究較多。其轉錄本B在腫瘤組織和正常組織中表達差異不大,被普遍認為是沒有特殊生物學功能的基因,一直沒有受到重視。本研究采用 RT-PCR方法,在 5種腫瘤細胞中擴增出 RASSF1基因,進行測序驗證,發現在不同的癌變細胞系中,RASSF1B雖都有表達,但表達量存在明顯的差異,在肺癌細胞系及白血病細胞系中表達量高。而在這幾種腫瘤細胞系中并未明顯地擴增出轉錄本 A的片段,提示 RASSF1B的表達量可能與腫瘤的類型有關,其在不同種類的癌變細胞中所起的作用可能不同。

生物信息學分析發現,RASSF1B含有一個 Ras結合區域和一個 SARAH區域。Ras區域是該家族共有的區域。Ras通路是所有細胞都具有的一條高度保守的信號傳遞通路。Ras蛋白在有活性的 GTP結合構象和無活性的 GDP結合構象之間轉化,與不同的效應物分子激活多條信號傳遞通路。有文獻[6]報道,RASSF1B是通過 Ras區域以 GTP方式直接與Ha-Ras相結合。SARAH區域可以調節細胞信號轉導[7]。活化的Ras蛋白具有促進細胞生長增殖的作用,RASSF1B基因可能通過 GTP方式直接與Ha-Ras相結合,通過抑制 Ras的激活途徑而抑制細胞生長、促進細胞凋亡;RASSF1B能通過阻斷 Cyclin D1的積累及細胞周期 G1/S期的進展而抑制腫瘤生長[8]。需進一步通過 RNA干擾等方法,抑制RASSF1B基因的表達,然后分析細胞的生長狀態,以明確該基因與細胞增殖間的關系。

[1]安錦霞,楊永秀,黎衛平,等.RASSF1A基因在宮頸癌組織中的表達及意義[J].國外醫學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2005, 11(3):258-260.

[2]Reinhard D,Chun L,Jung-Hoon Y,et al.Epigenetic inactivation of a RAS association domain family protein from the lung tumor suppressorlocus 3p21.3[J].Nat Gene,2000,25(3):315-319.

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[4]陳勇軍,鄒聲泉.RASSF 1基因研究進展[J].國外醫學:遺傳學分冊,2004,27(3):155-158.

[5]WangW,Ji P,Steffen B,et al.Alterations of lymphoid enhancer factor-1 isoform expression in solid tumors and acute leukemias[J].Acta Biochim Biophys Sin,2005,37(3):173-180.

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[7]張劍英,李智.RASSF1基因與腫瘤的關系[J].國外醫學:臨床生物化學與檢驗學分冊,2005,26(2):120-122.

[8]Polesello C,Huels mann S,Brown N,et al.The drosophila RASSF homolog antagonizes the hippo pathway[J].Curr Biol,2006,16 (24):2459-2465.