利用酶解法測定復合維生素溶液中維生素A含量的研究

趙小華 吳桂英 寇賀紅 鄭彥麗 趙桂廷

利用酶解法測定復合維生素溶液中維生素A含量的研究

趙小華 吳桂英 寇賀紅 鄭彥麗 趙桂廷

建立堿性蛋白酶-高效液相色譜法測定復合維生素溶液中維生素A的含量。利用堿性蛋白酶的方法處理樣品，并采用 EcoSic HPLC Coumw-ODS，C18 柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）分離,檢測波長為326 nm，流動相為甲醇+水（95+5）等高效液相色譜條件檢測樣品中維生素A的含量。結果顯示，樣品中維生素A與其他組分分離良好，維生素A濃度在120～600 IU/ml范圍內線性關系良好（r=0.999 7）,平均回收率在99.9%（n=5）,RSD為1.0%。本方法簡便、快捷，結果準確、可靠、重現性好，可作為企業控制生產過程中復合維生素溶液質量的方法之一。

堿性蛋白酶；高效液相色譜法；復合維生素溶液；維生素A

維生素A（Vitamin A）又稱視黃醇，是1913年美國化學家臺維斯從鱈魚肝中提取得到一種不溶于水，易溶于脂肪、油等有機溶劑的黃色粉末。其主要生理功能包括：維持視覺、促進生長發育、維持上皮結構的完整與健全、加強免疫能力、清除自由基等。因此常作為補充動物營養、提高生產性能的維生素之一。1999年國家質量技術監督局頒布的國家標準——飼料中維生素A的測定適用于復合維生素預混料中維生素A的測定。由于飼料中成分復雜，樣品前處理需要經過一系列的皂化、提取、濃縮等方法處理，最后采用高效液相色譜法測定維生素A含量雖然很好，但是由于復合維生素預混料成分相對簡單，再利用該法控制質量，其操作過程不僅費時費力，而且檢測結果的精確性還與檢測人員實驗技能操作熟練程度有關。因此國內飼料添加劑企業想通過尋找一種簡便、快捷、可靠的方法測定復合維生素預混料中維生素A的含量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器與色譜條件

高效液相色譜儀:Agilent Technologies 1200series；色譜條件：色譜柱EcoSic HPLC Coumw-ODS、C18柱（4.6 mm×200 mm，5 μm）、檢測波長 326 nm、流動相為甲醇+水（95+5）、流速為 2.0 ml/l、進樣量為 10 μl、柱溫35℃；萬分之一分析天平：Sartorius Bs224s。

1.2 試劑

對照品為維生素A乙酸酯：批號K0210906,100萬IU/ml，中國獸藥監察所；堿性蛋白酶：批號090926，10萬IU/g，浙江海寧金潮實業有限公司；復合維生素溶液（主要成分為VA、VD、VE，標示量分別為 12 000、8 000、8 IU/ml）：批號 091030、091108、091125，佛山市南海東方澳龍制藥有限公司生產；空白樣品（不含主要成分的復合維生素溶液，自制）；10%氨水溶液（自制）；純化水（自制）；無水乙醇（分析純）；甲醇（色譜純）。

2 方法和結果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取對照品（維生素A乙酸酯）60 mg置100 ml的棕色容量瓶中，精密量取10 ml的10%氨水溶液置棕色容量瓶中，再加50 ml的無水乙醇，超聲使其溶解，再精密稱取堿性蛋白酶1 g加入到棕色容量瓶中，振搖，用無水乙醇稀釋至刻度后在超聲10 min,先用濾紙過濾，再用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取過濾液即得，圖1為對照品的HPLC圖譜。

2.2 供試品溶液的制備

精密量取復合維生素溶液5 ml到100 ml棕色容量瓶中，精密量取10 ml的10%氨水溶液置棕色容量瓶中，再加50 ml的無水乙醇，超聲使其溶解，再精密稱定堿性蛋白酶1 g加入到棕色容量瓶中，振搖，用無水乙醇稀釋至刻度后在超聲10 min,先用濾紙過濾，再用微孔濾膜（0.45 μm）過濾，取過濾液即得供試品溶液，圖2為供試品的HPLC圖譜。

2.3 空白實驗

精密量取空白樣品5 ml，分別按照2.2項方法處理樣品，結果見圖3。結果顯示空白樣品對該系統沒有干擾。

2.4 線性關系考察

精密稱取 2.1 節對照品溶液 1、2、3、4、5 μl分別注入液相色譜儀，以色譜峰面積（Y）為縱坐標，進樣量（μl，X）為橫坐標繪制維生素A乙酸酯標準曲線，并得出回歸方程Y=230.2X+48.4（R=0.999 7），維生素A乙酸酯在120～600 IU/ml的范圍呈良好線性關系，標準曲線見圖4。

圖1 對照品維生素A乙酸酯的HPLC圖譜

圖2 復合維生素溶液中維生素A的HPLC圖譜

圖3 空白樣品的HPLC圖譜

圖4 對照品維生素A乙酸酯標準曲線

2.5 精密度實驗

精密吸取對照品溶液10 μl，連續進樣5次測定其峰面積，根據連續進樣5次測定的峰面積，計算出RSD=0.40%。

2.6 穩定性實驗

取同一批號供試品溶液按1.1節色譜條件0、10、20、30、50 min、1 h、2 h 進樣，分別測定其峰面積（見表1）。經過在不同時間點測定樣品的峰面積值，結果表明，樣品在2 h內無明顯的變化,說明實驗過程中樣品的穩定性良好。

表1 供試品穩定性實驗結果

2.7 重現性考察

精密量取同一批號供試品5 ml共6份，按照2.2項下制備供試品溶液，和1.1項下色譜條件測定維生素A的含量，結果見表2。

表2 供試品重現性考察結果

通過連續6次測定樣品的峰面積值，利用對照品比值法計算出的結果表明重現性良好。

2.8 回收率實驗

精密量取復合維生素溶液5 ml，添加已知準確含量的維生素A乙酸酯原料0.06 g（精確至0.000 2 g），測定其回收率，結果見表3。

表3 維生素A乙酸酯回收率實驗結果

由表3可知，樣品的平均回收率為99.9%（RSD=1.0%），說明通過酶解法測定復合維生素溶液中維生素A具有良好的回收率。

2.9 樣品含量測定

分別精密量取3個批號的供試品各5 ml和對照品（維生素A乙酸酯）60 mg，分別按照2.2節和2.1節方法制備供試品溶液和對照品溶液，并按照1.1節色譜條件檢測維生素A的含量，結果見表4。

表4 3批供試品中維生素A含量的測定結果

3 討論

3.1 測定方法的選擇

復合維生素預混料的傳統檢測方法樣品前處理需要經過一系列的皂化、提取、濃縮等方法處理，最后采用高效液相色譜法測定維生素A含量雖方法很好，但其操作過程不僅費時、費力，而且檢測結果的精確性還與檢測人員實驗技能操作熟練程度有關。參考郭芙蓉等（2006）和蔣一昕（2003、2005）的研究方法和維生素A乙酸酯微粒的檢測方法，并經過長期不斷的實踐，結果發現，采用堿性蛋白酶酶解處理復合維生素預混料后，采用高效液相色譜法測定維生素A含量不僅簡便快捷，而且結果準確、可靠。

3.2 樣品處理

在實驗過程中，所有樣品前處理首先用10%氨水溶液與50 ml的無水乙醇溶解，并且一定要等待樣品完全溶解后再加堿性蛋白酶，如果過早加入堿性蛋白酶，會使得堿性蛋白酶與樣品包粘在一起，而導致酶解不完全。

3.3 堿性蛋白酶

樣品處理過程中堿性蛋白酶的添加量與取樣量中維生素A的含量有一定的關系，即堿性蛋白酶的添加量（萬IU）與取樣量中維生素A的標示量（萬IU）比值不得少于10/6。如果取樣量中維生素A的標示量異常高時，堿性蛋白酶的添加量應為常規添加量的兩倍以上，這樣才能保證堿性蛋白酶使樣品完全酶解。

3.4 波長的選擇

根據HPLC掃描的三維立體色譜圖（波長在200～500 nm）顯示維生素A有吸收，結合等吸收圖和圖1、圖2綜合考慮，確定在326 nm處作為復合維生素溶液的檢測波長。

4 小結

使用堿性蛋白酶-高效液相色譜法測定復合維生素溶液中維生素A乙酸酯含量的方法簡便、快捷、結果準確、可靠、重現性好，故能夠更好地控制產品質量，并為飼料添加劑企業提供復合維生素預混料內部控制質量標準作參考。

[1] 曹威榮，張春善.淺談維生素A在家禽體內的代謝及營養作用[J].飼料博覽，2006（4）：45-48.

[2] 郭芙蓉,杜紅鴿.酶解法測定飼料中維生素A、E的含量[J].河南畜牧獸醫,2006（1）:8.

[3] 蔣一昕.酶解法測定飼料中維生素A含量[J].獸藥與飼料添加劑,2003（6）:26-27.

[4]蔣一昕.反相高效液相色譜法測定預混合飼料中維生素A乙酸酯的含量[J].中國獸藥雜志,2005,39（2）:14-18.

S816.17

趙小華，佛山市南海東方澳龍制藥有限公司，528234，廣東省佛山市南海松崗松夏工業園科技西路。

吳桂英、寇賀紅（通訊作者）、鄭彥麗、趙桂廷，單位及通訊地址同第一作者。

2010-02-01

（編輯：高 雁，snowyan78@tom.com）