植物免疫系統中RNAi的作用機制和應用

胡士斌

摘要RNAi作為廣泛存在于生物中的一種古老現象,是生物抵抗異常DNA的一種保護機制,在植物體內充當免疫系統的角色。就RNAi的作用機制及其在植物抗病毒方面的應用進行了綜述。

關鍵詞RNAi;植物免疫;作用機制;應用

中圖分類號Q352文獻標識碼A文章編號 1007-5739(2009)14-0354-01

RNAi是通過雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)介導特異性地降解靶mRNA,使靶基因發生沉默;RNAi作為廣泛存在于生物中的一種古老現象,是生物抵抗異常DNA的一種保護機制。它可以識別外來DNA分子,使之沉默,并且穩定和放大這種應答,是植物體內的免疫系統,抵御著病毒等異常DNA的入侵。

1RNAi的發現

1990年Napoli等[1]向矮牽牛中導入多拷貝查爾酮合成酶基因以期產生顏色更深的紫色矮牽牛花,結果許多花朵的顏色不但沒有加深,反而變成白色或花白色;他把這種奇怪的現象稱為“共抑制”。1995年,康乃爾大學的Guo和Kempheus[2]利用反義RNA(antisense RNA)技術特異性地阻斷線蟲(C. elegans)中的par-1基因的表達以期得到與對照組注射正義RNA(sen se RNA)相反的結果,但結果卻令他們費解:二者同樣阻斷了par-1基因的表達途徑。直到1998年,Fire和Mello等[3]首次將正義鏈和反義鏈的混合物注入線蟲,結果表現出比單獨注射正義鏈或者反義鏈都要強得多的基因沉默(gene silencing)。將這種現象稱為RNA干擾(RNA in terference,RNAi)。隨后,RNAi現象在真菌、擬南芥、水螅、渦蟲、錐蟲、小鼠等大多數真核生物中廣泛地發現。

2RNAi的分子機制

RNA沉默是存在于生物中的一種古老現象,是生物抵抗異常DNA(病毒、轉座因子和某些高重復的基因組序列)的保護機制,同時在生物發育過程中扮演著基因表達調控的角色,它可以通過降解RNA、抑制翻譯或修飾染色體等方式發揮作用。RNAi的機制可能是細胞內雙鏈RNA在酶的作用下,形成約22個堿基大小的小干擾RNA(small inte-rfering RNAs,siRNAs),siRNAs可進一步摻入多組分核酸酶(multicomponent nuclease)并使其激活,從而精確降解與siRNAs序列相同的mRNA,完全抑制了該基因在細胞內的翻譯和表達。RNAi機制過程中一種被稱為Dicer的酶首先被鑒定出來,它是RNase Ⅲ家族中特異識別雙鏈RNA的一種。Dicer 能將長的雙鏈RNA切割降解為19～23個堿基長的小分子干擾核糖核酸(siRNA)。這是一個依賴ATP的耗能過程,切割后的siRNA 3′具有2個核苷酸TT突出末端。然后siRNA結合到核糖核酸酶復合物上形成RNA誘導的基因沉默復合體(RNA-induced silencing complex,RISC)。該復合體依賴ATP釋能而解聚siRNA雙鏈成單鏈以激活RISC。活化的RISC通過由siRNA決定的堿基互補配對原理切割具有同源序列的基因轉錄體,最終導致基因沉默效應(圖1)[4]。

解開siRNA的雙鏈后,反義RNA鏈能作為雙鏈RNA合成的一個引物,以mRNA為模板,在RISC中的RNA依賴RNA聚合酶(RNA-dependent RNApolymerases,RdRPs,又稱作RDRs)的作用形成新的dsRNA,再次被Dicer 識別并切斷,形成新的siRNA再循環作用于另外的靶向mRNA。這種不斷放大的瀑布式作用形成大量新的siRNA,使RNAi作用在短時間內達到迅速并有效地抑制mRNA翻譯形成蛋白質或多肽,從而有效地抑制了靶向基因蛋白質或多肽的合成[5]。

除上述轉錄后基因沉默外,還有轉錄水平的基因沉默。反向重復的基因或轉基因,無論它們是緊密相連,還是被其他序列隔開,都可以進行異位配對,配對的DNA作為信號導致一系列反映,包括甲基化、異染色質化[6]或RNA的降解,最終造成基因不能正常表達。通過抑制重復序列的轉錄產物,RNAi引導異染色質形成,阻礙有可能換位的成分和其他外源DNA整合到基因組[7],這是外源基因插入后生物體的一種自我保護。

3利用RNAi產生抗病毒植物

RNA干擾現象本身就是植物天然的病毒防御系統。利用轉基因技術將與病毒同源的dsDNA的hpRNA載體整合到植物基因組,表達后就會引起病毒基因組的特異性降解,阻止病毒的復制擴散,獲得穩定遺傳的抗病毒植物。1998年,Waterhouse等[8]利用馬鈴薯Y病毒(PVY)蛋白酶基因片段構建IRS載體進行煙草轉化,獲得抗性植株。水稻黃斑病毒(RYMV)感染是非洲水稻的嚴重病害,它可使水稻植株出現黃斑、矮化、葉片變窄、抽穗少、籽粒不實等癥狀。Pinto YM等[9]將編碼該基因的一關鍵酶的基因轉入水稻,誘發該基因沉默,從而使植物具有黃斑病毒的抗性,從而育成了可抗非洲各地RYMV的水稻品種,且能穩定遺傳3代。Wang等利用含有大麥黃矮病毒(Barleyyellowdwarfvirus,BYDV)PAV株系的復制酶基因片斷構建成可產生發夾式RNA結構的載體,將該載體導入大麥得到強抗性植株并得到穩定遺傳。

在植物體內,RNAi是一種防御機制,它可以針對RNA病毒和轉位子產生天然免疫反應;但阻礙宿主防御反應的調節因子已在植物病毒中發現。這些病毒表達阻礙因子,如dsRNA連接蛋白,可以干擾宿主細胞的RNA沉默機制。P19是病毒抑制物蛋白之一,它以同型二聚體形式識別siRNA雙鏈復合物并與之共結晶,從而阻斷RNAi。在植物中一些RNAi阻礙因子以RISC為靶向或限制系統沉默信號的傳播,從而抑制RNAi[10],這為理解植物免疫系統和抗病育種提供了新的思路。

4參考文獻

[1] NAPOLI C,LEMIEUX C,JORGENSEN R. Introduction of a chalcone synthase gene into Petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans[J]. Plant Cell,1990(2):279-289.

[2] GUO S,KEMPHEUS K J. Par-I,a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos,encodes a putative Ser/ Thr kinase that is asymmet rically distributed[J]. Cell,1995(81):611-620.

[3] FIRE A,XU S,MONTGOMERY M K,et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans[J]. Nature,1998(391):806-811.

[4] TUSCHL T,ZAMOREP D,LEHMANN R,et al. Targeted mRNA degradation by double-stranded RNA in vitro[J].Genes Dev,1999,13(24):3191-3197.

[5] BRUMMELKAMP T R,BERNARDS R,AGAMI R. A system for stable expression of short interfering RNAs in mammalian cells[J]. Science,2002,296(5567):550-553.

[6] WASSENEGGER M. The role of the RNAi machinery in heterochro-matin formation[J]. Cell,2005,122(1):13-16.

[7] AIT SI,GUASCONI V,HAREL BELLAN A. RNA interferenceand its possible use in cancer therapy[J]. Bull Cancer,2004,91(1):15-18.

[8] WATERHOUSE P M,GRAHAM M W,WANG M B. Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA[J].PNAS,1998,95(23):1359-1364.

[9] PINTO Y M,KOK R A,BAULCOMBE D C. Resistance to rice yellow mott levirus(RYMV)in cult ivated African rice varieties containing RYMV transgenes[J]. Nature Biotechnology,1999(17):702-707.

[10] MEISTER G,TUSCHL T. Mechanisms of gene silencing by double-stranded RNA[J]. Nature,2004,431(7006):343-349.