分子標(biāo)記及其在核桃種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

陳 霞 陳少瑜 陸 斌 李文祥 張 雨

摘要介紹了分子標(biāo)記技術(shù)的類型,以及目前常用的幾種分子標(biāo)記技術(shù)(RFLP、AFLP、RAPD、SSR、ISSR等)的基本原理、特點(diǎn),綜述了分子標(biāo)記技術(shù)在核桃種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用情況,并對(duì)目前分子標(biāo)記研究存在的問題及前景作了分析。

關(guān)鍵詞分子標(biāo)記;核桃;種質(zhì)資源;應(yīng)用

中圖分類號(hào)Q819文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào) 1007-5739(2009)14-0347-04

分子標(biāo)記也稱為DNA分子遺傳標(biāo)記,或DNA標(biāo)記,是繼形態(tài)學(xué)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記及生化標(biāo)記之后,近年來被廣泛應(yīng)用的一種新的遺傳標(biāo)記。分子標(biāo)記從分子水平反映生物個(gè)體間或種群間具有差異特征的DNA片段,直接反映基因組DNA間的差異,從而為解釋各物種間的親緣關(guān)系奠定了技術(shù)理論基礎(chǔ)[1]。DNA標(biāo)記能對(duì)各個(gè)發(fā)育時(shí)期的個(gè)體、組織、器官進(jìn)行檢測(cè),不受發(fā)育階段及環(huán)境的影響,且遺傳穩(wěn)定、數(shù)量豐富。DNA分子標(biāo)記對(duì)生物的影響表現(xiàn)為中性,有些標(biāo)記為共顯性,且對(duì)選擇隱性基因控制的性狀十分有利。至DNA標(biāo)記誕生到現(xiàn)在,發(fā)展迅猛,日臻成熟。目前,DNA標(biāo)記被廣泛地應(yīng)用于植物遺傳育種、基因定位、基因克隆以及分子輔助選擇等研究領(lǐng)域。

我國(guó)是核桃屬(Juglans)植物分布中心之一,原產(chǎn)于我國(guó)的有5個(gè)種,其中核桃(J. regia L.)和鐵核桃(J. siggillata L.)具有極大的商業(yè)堅(jiān)果栽培價(jià)值[2-5]。隨著核桃屬作物大規(guī)模商業(yè)化的快速發(fā)展,以及品種選育、鑒定、推廣及種質(zhì)資源收集和保護(hù)工作的深入開展,形態(tài)描述、地理來源以及同工酶等方法由于自身存在局限性而難以滿足核桃屬植物研究和開發(fā)的需要,分子標(biāo)記技術(shù)將成為上述工作的有效工具。

1分子標(biāo)記的類型

DNA分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式體現(xiàn),大致可分為兩大類[1]。第1類是非PCR依賴的分子標(biāo)記(基于Southern雜交的分子標(biāo)記),包括限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(restriction fragment length polymorphism DNA,RFLP)、原位雜交(in situ hybridization)等;第2類DNA標(biāo)記基于PCR技術(shù),主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記(random amplification polym-orphism DNA,RAPD)、DNA擴(kuò)增指紋印跡(DNA amplifi-cation fingerprinting,DNA)、簡(jiǎn)單序列重復(fù)標(biāo)記(Simple seq-uence repeat,SSR)、隨機(jī)引物聚合酶鏈反應(yīng)(arbitrarily primed PCR,AP-PCR)以及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性標(biāo)記(amplified fragment length polymorphism,AFLP)等。

也有分為5類的劃分法,即在前2類的基礎(chǔ)上增添后3類。第3類以重復(fù)序列為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記,包括衛(wèi)星DNA(satellite DNA)、微衛(wèi)星DNA(microsatwllite DNA)、小衛(wèi)星DNA以及簡(jiǎn)單重復(fù)序列等;第4類是以單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù),如單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP);第5類是以mRNA為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù),包括差異顯示(differental display,DD)、逆轉(zhuǎn)錄PCR、表達(dá)順序標(biāo)簽(expressed sequence taqs,EST)等[6]。由此可見,各類之間也存在著交叉,如第3類中的微衛(wèi)星DNA也可以歸于第2類以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù)。

2幾種常用分子標(biāo)記的原理和特點(diǎn)

2.1RFLP(Restriction Fragment length Polymorphsm)

RFLP即限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性,它作為遺傳工具是由Grozdicker于1974年創(chuàng)立,Botesin于1980年再次提出,是最早應(yīng)用的分子標(biāo)記技術(shù)[6,7]。DNA中特定限制性酶切位點(diǎn)上堿基對(duì)的改變及酶切位點(diǎn)之間的分子重排事件(如缺失、倒位、易位等)是產(chǎn)生RFLP的分子基礎(chǔ)。其基本原理是由限制性內(nèi)切酶酶解樣品DAN,遺傳組成不同的個(gè)體間的DNA可產(chǎn)生大小不同的片段,經(jīng)電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜等支持物上,通過與經(jīng)過放射性同位素或者非放射性物質(zhì)標(biāo)記的特定DNA片段(探針)雜交,最后通過放射自顯影或酶學(xué)檢測(cè)不同材料對(duì)特定探針的多態(tài)性。該標(biāo)記實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定可靠,在遺傳上呈共顯性;不足在于實(shí)驗(yàn)成本較高,DNA所需量較大,實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜,檢測(cè)周期長(zhǎng),檢測(cè)效率低,此外同位素探針容易造成環(huán)境污染。

2.2RAPD(Random Amplifiled Polymorphic DNA)

為克服RFLP技術(shù)上的缺點(diǎn),Williams等[8]于1990年建立了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)DNA(RAPD)技術(shù)。RAPD基本原理是利用1個(gè)隨機(jī)引物(8～10個(gè)堿基)通過PCR反應(yīng)非定點(diǎn)地?cái)U(kuò)增DNA片段,然后用凝膠電泳分離擴(kuò)增片段來研究DNA多態(tài)性。較之RFLP、RAPD技術(shù)簡(jiǎn)單,檢測(cè)速度快,DNA用量少,實(shí)驗(yàn)設(shè)備簡(jiǎn)單,不需DNA探針,設(shè)計(jì)引物也不需要預(yù)先克隆標(biāo)記或進(jìn)行序列分析,不依賴種屬特異性和基因組結(jié)構(gòu),1套R(shí)APD引物可以用于分析不同生物基因組,用1個(gè)引物就可擴(kuò)增出許多片段,且不需要同位素,安全性好;但RAPD技術(shù)受諸多因素影響,穩(wěn)定性和重復(fù)性較差[9],呈顯性標(biāo)記而不能區(qū)分雜合子和純合子。

2.3AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism)

AFLP擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)型,是1993年由荷蘭Keygene公司的科學(xué)家Zabeau和Vos發(fā)明的一種DNA分子標(biāo)記新技術(shù)[10],是在PCR技術(shù)和RFLP標(biāo)記技術(shù)的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的。用限制性內(nèi)切酶雙酶切基因組DNA,形成分子量大小不等的隨機(jī)限制性片段,再在片段兩端接上特定接頭,通過接頭序列和PCR引物3′末端的識(shí)別后,特異性片段經(jīng)變性、退火和延伸周期性循環(huán)擴(kuò)增,最終利用聚丙烯酰胺電泳分子篩作用將這些特異的限制性片段分離開來。AFLP在技術(shù)上是RAPD和PFLP的結(jié)合,既具RFLP的可靠性,又有RAPD的靈敏性,是分子標(biāo)記技術(shù)重大突破,目前被認(rèn)為是一種十分理想、有效的分子標(biāo)技術(shù);缺點(diǎn)是操作技術(shù)較復(fù)雜,DNA要求純度高,實(shí)驗(yàn)成本相應(yīng)增加。

2.4SSR(Simple Sequence Repeats)和ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)

1991年,Moore等在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上創(chuàng)立了SSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列)標(biāo)記技術(shù)[11]。SSR是一類由幾個(gè)(多為1～5個(gè))堿基串聯(lián)重復(fù)而成的DNA序列,其中最常見是雙核苷酸重復(fù)即(CA)n和(TG)n,在植物基因中(AT)n最多。每個(gè)微衛(wèi)星DNA的核心序列結(jié)構(gòu)相同,重復(fù)單位數(shù)目10～60個(gè),其高度多態(tài)性主要來源于串聯(lián)數(shù)目的不同。不同遺傳材料重復(fù)次數(shù)不同,導(dǎo)致SSR長(zhǎng)度的高度變異性,這一變異性正是SSR標(biāo)記產(chǎn)生的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記技術(shù)根據(jù)微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的特定短序列設(shè)計(jì)引物,通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增微衛(wèi)星片段。核心序列重復(fù)次數(shù)不同,從而擴(kuò)增出不同長(zhǎng)度的PCR產(chǎn)物,這是檢測(cè)DNA多態(tài)性的一種有效方法。

在SSR標(biāo)記中,采用PCR反應(yīng)必須知道擴(kuò)增DNA片段兩側(cè)序列,多數(shù)情況下某些序列本身或其旁側(cè)序列并不清楚,且由于SSR引物具有物種特異性,引物設(shè)計(jì)費(fèi)時(shí)耗力,要檢測(cè)多個(gè)基因座是不現(xiàn)實(shí)的,這就限制了PCR技術(shù)的應(yīng)用。

1994年Zietkiewicz等對(duì)SSR技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展,建立了加錨微衛(wèi)星寡核苷酸技術(shù)[12],即簡(jiǎn)單重復(fù)間區(qū)(ISSR)或以微衛(wèi)星為引物的PCR技術(shù),可以克服上述SSR的障礙。他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物,即在SSR的5′端或3′端加上2～4個(gè)隨機(jī)選擇的核苷酸,這可引起特定位點(diǎn)退火,從而導(dǎo)致錨定微衛(wèi)星引物間的基因節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這類標(biāo)記又被稱為ISSR或ASSR。在所用的兩端引物中,一個(gè)是錨定引物,另一個(gè)是隨機(jī)引物。

SSR和ISSR與上述幾類標(biāo)記相比,具有穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),兩者都是以重復(fù)序列和PCR擴(kuò)增為基礎(chǔ),被列為第2代分子標(biāo)記技術(shù)。

3分子標(biāo)記技術(shù)在核桃種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用

隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展與日趨成熟,其已經(jīng)廣泛應(yīng)用于果樹研究中[13-15],分子標(biāo)記技術(shù)在核桃種質(zhì)資源研究中的應(yīng)用主要有以下幾方面。

3.1品種起源鑒定與分類

核桃起源問題一直是許多學(xué)者較有爭(zhēng)議的問題,也為此做了一些探索研究[16],而正確地分類是搞清起源問題的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的植物分類主要采用形態(tài)指標(biāo),但形態(tài)指標(biāo)容易受外界環(huán)境的影響而發(fā)生飾變,從而導(dǎo)致分類偏差。由于遺傳變異不僅表現(xiàn)在外部形態(tài)、蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)等方面,DAN非編碼區(qū)域的變異對(duì)于生物的遺傳和進(jìn)化也起著重要作用,故在分類方面,借助分子標(biāo)記技術(shù)可以較全面地對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行比較分析,提高分類的準(zhǔn)確性和可靠性。

1998年,Nicese等[17]用RAPD標(biāo)記分析了19個(gè)核桃品種的遺傳關(guān)系,聚類分析結(jié)果顯示與經(jīng)典的分類結(jié)果一致,表明RAPD標(biāo)記能準(zhǔn)確反映彼此的系譜關(guān)系,首次為核桃的育種及種質(zhì)資源分析奠定了基礎(chǔ)。吳燕民等[18]用RAPD法對(duì)麻核桃的起源與分類地位進(jìn)行了分析,指出核桃揪×核桃的天然雜交是麻核桃形成的主要機(jī)制;在麻核桃形成過程中,核桃揪的遺傳貢獻(xiàn)率大于核桃;在胡桃屬分類中,麻核桃應(yīng)歸為核桃鍬組,這與傳統(tǒng)分類學(xué)的結(jié)果一致。吳燕民等[19]用RAPD技術(shù)對(duì)核桃屬內(nèi)9個(gè)種及近緣屬的2個(gè)種進(jìn)行了基因組DNA多態(tài)性分析,結(jié)果表明,鐵核桃為核桃屬中一個(gè)獨(dú)立種;核桃屬內(nèi)組間和種間親緣關(guān)系與經(jīng)典分類學(xué)的結(jié)果完全一致。劉曉麗[20]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)新疆伊犁野核桃、喀什實(shí)生核桃及部分栽培品種的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析,初步提出伊犁野核桃、喀什實(shí)生核桃和栽培品種的親緣演化關(guān)系圖,為“我國(guó)是世界栽培核桃的起源中心之一”[21]的論斷進(jìn)一步提供了分子證據(jù),并為栽培核桃品種的進(jìn)一步選育提供分子依據(jù)。

3.2遺傳多樣性分析

遺傳多樣性即基因多樣性,體現(xiàn)在分子、細(xì)胞和個(gè)體3個(gè)水平上,是生命進(jìn)化和物種分化的基礎(chǔ)。一個(gè)物種的遺傳變異愈豐富,它對(duì)生存環(huán)境的適應(yīng)能力便愈強(qiáng);而一個(gè)物種的適應(yīng)能力愈強(qiáng),則它的進(jìn)化潛力也愈大。對(duì)核桃各種屬的遺傳多樣性研究,有利于對(duì)核桃種質(zhì)資源的保護(hù)并為核桃育種提供一定的理論依據(jù)。

奇異核桃Paradox是美國(guó)北加州黑核桃與普通核桃(J.hindsii×J. regia)的雜種后代的統(tǒng)稱,是加州核桃產(chǎn)業(yè)的重要砧木。為了搞清楚Paradox的遺傳背景,Daniel Potter等[22]對(duì)5種北美黑核桃進(jìn)行了核DNA和葉綠體DAN的3個(gè)非編碼區(qū)的ITS序列分析,并對(duì)27個(gè)Paradox居群作了分子檢測(cè),結(jié)果顯示,所采用的Paradox砧木的基因中有很大部分是來自J. hindsii以外的其他種。徐鄭等[23]運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)川西高原及秦巴山區(qū)核桃作了研究,指出前者遺傳多樣性高于后者。陳良華等[24]用AFLP技術(shù)對(duì)四川省的3個(gè)野生核桃種群和1個(gè)野生鐵核桃種群共46個(gè)品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析,得出鐵核桃群體遺傳多樣性水平略高于核桃群體,且群體內(nèi)的遺傳多樣性大于群體間。郝艷賓等[25]運(yùn)用已開發(fā)的黑核桃SSR引物探索出適合核桃屬SSR標(biāo)記的引物,得出有72.78%的黑核桃SSR引物能應(yīng)用于核桃屬,能進(jìn)一步用于核桃屬的遺傳多樣性研究。并用SSR技術(shù)對(duì)我國(guó)核桃組種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析[26],認(rèn)為我國(guó)核桃栽培實(shí)生群可劃分為新疆核桃、華北核桃和西藏核桃三大相互獨(dú)立的地理生態(tài)類型,而秦巴山地核桃應(yīng)分別屬于華北和新疆2個(gè)地理生態(tài)型。李同和[27]利用AFLP銀染技術(shù),對(duì)四川省3個(gè)核桃居群和1個(gè)鐵核桃居群的共46個(gè)樣品進(jìn)行遺傳多樣性分析、居群遺傳結(jié)構(gòu)分析及種屬關(guān)系探討。指出鐵核桃居群遺傳多樣性水平略高于核桃居群,各種多態(tài)性指數(shù)表明居群內(nèi)的遺傳多樣性大于居群間,這為核桃種質(zhì)資源的保護(hù)和育種提供一定的理論依據(jù)。在對(duì)四川西部核桃屬植物遺傳多樣性的研究過程中,王寶慶[28]的研究結(jié)果與李同和的較一致。王滑等[29]也用SSR標(biāo)記技術(shù)對(duì)中國(guó)核桃的8個(gè)天然居群進(jìn)行遺傳多樣性分析,統(tǒng)計(jì)分析得出云南麗江鐵核桃居群的遺傳多樣性最高,四川黑水核桃居群最低,同時(shí)得出8個(gè)居群間的遺傳距離與其地理距離有顯著的相關(guān)性。

3.3重要農(nóng)藝性狀的連鎖標(biāo)記

早實(shí)性是核桃生產(chǎn)的瓶頸性作用性狀,也是近年來核桃研究最多的一個(gè)農(nóng)藝性狀。核桃童期的長(zhǎng)短取決于該物種本身的特性,受基因控制。普通核桃中的晚實(shí)類群的童期長(zhǎng)達(dá)4～8年,極大地限制了核桃的栽培和育種。研究核桃早實(shí)基因的遺傳規(guī)律,尋找與其相連鎖的DNA分子標(biāo)記,從而克隆出核桃早實(shí)基因,這對(duì)核桃育種、栽培實(shí)踐和揭示木本植物童期發(fā)育的機(jī)理都有重要意義。

張虎平等[30]先利用表觀性狀將參試核桃分為早實(shí)和晚實(shí)2個(gè)集群,再利用RAPD技術(shù)篩選出一個(gè)與早實(shí)性狀相關(guān)的穩(wěn)定的標(biāo)記,最后將其成功地轉(zhuǎn)換為特異性的SCAR標(biāo)記。楊克強(qiáng)等[31]用BSA法獲得了與核桃早實(shí)性狀相關(guān)的RAPD標(biāo)記OPB-08958,并對(duì)早實(shí)和晚實(shí)核桃品種進(jìn)行了DNA擴(kuò)增,只在早實(shí)品種的擴(kuò)增產(chǎn)物中出現(xiàn)此條帶。并測(cè)出該標(biāo)記序列為核桃基因組所獨(dú)有,與核桃早實(shí)基因之間的遺傳距離為1.99cm[32]。此外,Nadia Goue等[33]用RACE技術(shù)(cDAN末端快速擴(kuò)增技術(shù))來隔離核桃CDKA基因的完整序列,并對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)與功能進(jìn)行了首次描述,據(jù)其報(bào)道該基因與核桃木徑向生長(zhǎng)和出材量有關(guān)。

3.4構(gòu)建指紋圖譜

傳統(tǒng)的植物學(xué)分類的理論基礎(chǔ)都建立于性狀分析,這些性狀大多是與環(huán)境緊密相關(guān)的表現(xiàn)型,加之核桃苗期各品種之間的性狀差異較小,在進(jìn)行苗木選購(gòu)時(shí)難免出現(xiàn)品種混雜、以次充好的現(xiàn)象,不利于核桃良種的推廣。指紋圖譜是指能夠反映生物個(gè)體間差異的電泳圖譜。由于它具有類似人類指紋的高度個(gè)體特異性和穩(wěn)定可靠性,故被稱為“指紋圖譜”。分子標(biāo)記出現(xiàn)后,DNA被迅速用作指紋圖譜分析,稱作DNA指紋圖譜。運(yùn)用DAN指紋圖譜能進(jìn)行品種的真實(shí)性和純度鑒定,確定品種的親緣關(guān)系,以及用于新品種登記和品種知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等。

陳良華等[34]運(yùn)用RAPD技術(shù)對(duì)核桃與鐵核桃特征性條帶進(jìn)行標(biāo)記,篩選出的引物D6能擴(kuò)增出核桃種的一條250bp的特異帶,鐵核桃中沒有,得出D6-250可能為核桃與鐵核桃之間的特異性分子標(biāo)記,為核桃與鐵核桃種質(zhì)鑒定提供一定的理論依據(jù)。陳少瑜等[35]運(yùn)用RAPD和ISSR標(biāo)記分別對(duì)云南核桃的11個(gè)主要栽培品種進(jìn)行遺傳多樣性分析,并構(gòu)建這11個(gè)品種的指紋圖譜。王紅霞[36]利用AFLP分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)普通核桃131份材料的遺傳多樣性進(jìn)行分析,構(gòu)建了核桃的核心種質(zhì),并對(duì)核桃種間的親緣關(guān)系進(jìn)行研究,將核桃屬8個(gè)種分為4個(gè)組:黑核桃組,野核桃、吉寶核桃和心形核桃組,鐵核桃、核桃楸和河北核桃組,普通核桃組。陳靜[37]在建立適合核桃的AFLP銀染技術(shù)體系的基礎(chǔ)上,構(gòu)建了58份核桃供試樣品的指紋圖譜,并對(duì)其遺傳多樣性進(jìn)行了分析,揭示了供試材料間遺傳背景的相似性及復(fù)雜性,為核桃的品種鑒定和產(chǎn)權(quán)保護(hù)提供了理論依據(jù)。

4應(yīng)用前景

近年來,在人類基因組研究的推動(dòng)下,NDA分子標(biāo)記的研究與利用得到迅速發(fā)展,并廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)與實(shí)踐。目前,果樹分子標(biāo)記的研究已取得實(shí)質(zhì)性進(jìn)展,并應(yīng)用到果樹育種的各個(gè)方向。核桃為多年生作物,性周期長(zhǎng),自交結(jié)實(shí)率低,個(gè)體雜合度高,植株高大,給普通遺傳學(xué)的研究帶來困難,由于對(duì)親本復(fù)雜的遺傳背景缺乏了解,果樹育種中的盲目性很大。分子標(biāo)記是輔助核桃遺傳育種研究的有力手段,將大大加快核桃育種的進(jìn)程,縮短育種年限,提高育種效率。

值得指出的是,在真核生物的DNA分子上同時(shí)存在著“Junk DAN”、內(nèi)含子和外顯子3種組成,雖然內(nèi)含子也是基因的組成部分,但卻在RNA離開細(xì)胞核時(shí),即轉(zhuǎn)錄前被剪除,只有外顯子能通過轉(zhuǎn)錄和翻譯等步驟形成蛋白質(zhì)。筆者認(rèn)為,目前開發(fā)的DAN分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)這3種組成不能進(jìn)行識(shí)別標(biāo)記,也就是說呈現(xiàn)的多態(tài)性標(biāo)記并不能全部轉(zhuǎn)化成為生物的性狀,其中存在著對(duì)生產(chǎn)無指導(dǎo)意義的部分。因此,DNA標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展有待于對(duì)DAN分子組成部分功能的研究。

分子標(biāo)記技術(shù)在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)滿足穩(wěn)定性好、分辨率高、多態(tài)性強(qiáng)和效率高等要求。充分考慮成本與效益等限制問題,該問題的解決有賴于分子生物學(xué)和其他相關(guān)學(xué)科的相互滲透和相關(guān)人員的更緊密合作。隨著NDA分子標(biāo)記的廣泛應(yīng)用、分子生物學(xué)及相關(guān)邊緣學(xué)科理論與技術(shù)的迅速發(fā)展,必然不斷開發(fā)出分析速度更快、成本更低、信息量更大的分子標(biāo)記。隨著NDA提取、純化的程序化,電泳分析的自動(dòng)化,數(shù)據(jù)處理計(jì)算機(jī)化及信息網(wǎng)絡(luò)化的進(jìn)一步發(fā)展,DNA分子標(biāo)記技術(shù)將在生產(chǎn)中發(fā)揮越來越大的作用。

5參考文獻(xiàn)

[1] 肖尊安.植物生物技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[2] 王利華.核桃的營(yíng)養(yǎng)保健功能及加工利用[J].中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng),2007(8):28-30.

[3] 陳朝銀,趙聲蘭,曹建新,等.核桃花營(yíng)養(yǎng)成分的分析[J].中國(guó)野生植物資源,1999,18(2):45-47.

[4] 李仁敏.核桃營(yíng)養(yǎng)及藥用研究進(jìn)展[J].營(yíng)養(yǎng)保健,2004(12):26-27.

[5] 陸斌,寧德魯,暴江山,等.核桃營(yíng)養(yǎng)藥用價(jià)值與加工技術(shù)研究進(jìn)展[J].果蔬加工,2006(4):41-43.

[6] 周延清.DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.

[7] 朱玉賢,李毅.現(xiàn)代分子生物[M].北京:高等教育版社,2002.

[8] WILLIAM J C K,KUHELIK A R,LIVAK K J. DNA polymnrphism amplified by arbitrary primers are useful genetie markers [J].Nucleic Acids Res,1990,18(2):6531-6537.

[9] 王志林,趙樹進(jìn),吳新榮,等.分子標(biāo)記技術(shù)及其進(jìn)展[J].生命的化學(xué),2001,21(1):39-42.

[10] VELAPPAM N,SONDGRASS J L,HAKOVIRTA J R.Rapid ident-ification of pattmgenic bacteria hy single-enzyme amplified fragment length polymorphism analysis[J].Diagnostic Microbiology and infections Disease,2001,39(4):77-83.

[11] 蔣彩虹,王元英,孫玉合,等.SSR和ISSR標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用進(jìn)展[J].中國(guó)煙草科學(xué),2007,28(2):1-5.

[12] ELDRDGE L,BALLARD R T BAIRD W VETA1.Application of RFLP analysis to genetic linkage mapping peachesC[J].Hortscence,1992,27(2):160-163.

[13] 高玉江,侯佳賢,鄭亞杰,等.分子標(biāo)記技術(shù)在落葉果樹上的應(yīng)用[J].吉林農(nóng)業(yè)科學(xué),2005,30(1):57-60.

[14] 馬翠蘭,劉星輝,張玉蘭,等.DAN分子標(biāo)記技術(shù)在果樹上的應(yīng)用[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,6(2):105-111.

[15] 彭建營(yíng),束懷瑞,孫仲序,等.分子標(biāo)記技術(shù)及其在果樹種質(zhì)資源研究上的應(yīng)用[J].山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2001,32(1):103-106.

[16] 楊源.云南核桃[M].昆明:云南科技出版社,2001.

[17] F P NICESE1,J I HORMAZA,G H MCGRANAHAN. Molecular characterization and genetic relatedness among walnut(Juglansr regia L.)genotypes based on RAPD markers[J].Euphytica,1998(101):199-206.

[18] 吳燕民,裴東,奚聲珂,等.用RAPD分析麻核桃起源與分類地位[J]林業(yè)科學(xué),1999,35(4):24-30.

[19] 吳燕民,等.運(yùn)用RAPD對(duì)核桃屬種間親緣關(guān)系的研究[J].園藝學(xué)報(bào),2000,27(1):17-22.

[20] 劉曉麗.核桃SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化及群體遺傳多樣性分析[D].泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[21] 楊文衡.我國(guó)的核桃田[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),1984(2):1-9.

[22] DANIEL POTTER,FANGYOU Gao & SCOTT BAGGETT1.De-fining the sources of Paradox:DNA sequence markers for North American walnut(Juglans L.)species and hybrids[J].Scientia Horticulturae,2002(94):157-170.

[23] 徐鄭,胡庭興,張帆,等.運(yùn)用RAPD對(duì)我國(guó)川西高原及秦巴山區(qū)核桃的研究[J].四川林業(yè)科技,2007,28(6):9-13.

[24] 陳良華,胡庭興,張帆,等.用AFLP技術(shù)分析四川核桃資源的遺傳多樣性[J].植物生態(tài)學(xué)報(bào),2008,32(6):1362-1372.

[25] 郝艷賓,肖永強(qiáng),齊建勛,等.微衛(wèi)星DNA在核桃屬近緣種同源性分析上的應(yīng)用[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,21(3):1-4.

[26] 郝艷賓,黃武剛,王克建,等.我國(guó)核桃組(Sect. Juglans)種質(zhì)資源的SSR標(biāo)記分析[J].果樹學(xué)報(bào),2007,24(5):620-625.

[27] 李同和.核桃種質(zhì)資源研究[D].雅安:四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[28] 王寶慶.四川西部核桃屬植物遺傳多樣性研究[D].呼和浩特:內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[29] 王滑,郝俊民,王寶慶,等.中國(guó)核桃8個(gè)天然居群遺傳多樣性分析[J].林業(yè)科學(xué),2007,43(7):42-46.

[30] 張虎平,牛建新,虎海防,等.與核桃早實(shí)性相關(guān)的RAPD標(biāo)記篩選及其SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)換[J].石河子大學(xué)學(xué)報(bào),2007,25(4):16-21.

[31] 楊克強(qiáng),王躍進(jìn),張銀東,等.核桃早實(shí)性狀的RAPD分析[J].園藝學(xué)報(bào),2002,29(6):573-574.

[32] 楊克強(qiáng),馬明,孫彩玲,等.核桃早實(shí)基因的RAPD標(biāo)記及其序列分析研究[J].中國(guó)林業(yè)科學(xué),2007,40(9):2021-2027.

[33] NADIA GOUE,GREGORY MONTIEL and ISABELLE LEVERT .CDKA orthologue isolation and its expression during cambial activity in hybrid walnut(Juglans nigra&Juglans; regia)[J].Original article Trees,2003(17):316-324.

[34] 陳良華,胡庭興,張帆,等.核桃與鐵核桃種間關(guān)系的RAPD鑒定[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,25(4):513-516.

[35] 陳少瑜,楊恩,張雨,等.云南核桃品種遺傳多樣性的RAPD和ISSR標(biāo)記研究[J].河北林果研究,2007,22(1):57-61.

[36] 王紅霞.核桃遺傳多樣性分析及核心種質(zhì)的構(gòu)建[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[37] 陳靜.核桃AFLP銀染技術(shù)體系的建立及指紋圖譜的構(gòu)建[D].保定:河北農(nóng)業(yè)大學(xué),2004.