miR-1184靶向COL1A1調節PI3K/Akt通路對 胃癌細胞增殖、侵襲、凋亡的影響

【關鍵詞】miR-1184；I型膠原α1鏈（COL1A1）;PI3K/Akt;胃癌;細胞功能 中圖分類號：R735.2 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2025.09.002

Effects of miR-1184 targeting COL1A1 on the proliferation， invasion， and apoptosis of gastric cancer cells via regulation of the PI3K/Akt signaling pathway

YANG Lu ?^a ，ZHENG Xin μ^u ，WANG Xin ?^b ， ZHANG Liwei°， ZHANG Weia （a. Department of Gastroenterology，b. Department of General Surgery，the Second Afliated Hospital of QiqiharMedical University，Qiqihar161oOo，Heilongjiang，China）

【Abstract】ObjectiveToinvestigate theexpresionand biological functionsof miR-184ingastriccancer，andfurther explore whether it affects the PI3K-Akt signaling pathwaybyregulating thecollagen type I alpha 1（COL1A1），andits efectsontheproliferation，invasionandapoptosisof gastriccancercells.MethodsSamplesofsomecancer tisues（30cases）andadjacent tisues（3Ocases）of patients with primary gastriccancer whounderwentsurgicalresectionat the Second Affiliated HospitalofQiqihar Medical UniversityfromOctober 2022 toAugust2O23werecolected.Theexpresionlevelsof miR-1184，COL1A1，PI3K andAkt in gastriccancercelsweredetected byRT-qPCR.miR-1184，COL1A1 andsi-PI3K wereaddedbycelltransfectiontechnology.Cell proliferationwasdetectedbyBrdUkit，andthecellmigrationandinvasion rates were determinedbyTranswellassy，and then cellapoptosis wasdetectedbyflowcytometryResultsIngastriccancer tissues，the expression level of miR-1184 was significantly lower than that in adjacent tissues （ Plt;0.001 ），and the expressions of COL1A1，PI3K and Akt were significantly higher than those inadjacent tissues（ Plt;0.001 ）.The expression of miR1184 was significantly negatively correlated with that of COL1A1 （ r=-0.988 ， Plt;0. 001 ），the expressions of PI3K andCOL1A1 were significantly positively correlated （ r=0，980 ， Plt;0. 001 ），and the expressions of PI3K and miR-1184 were significantlynegativelycorrelated（ r=-0.966 ， Plt;0. 001 ）.The overexpression ofmiR-1184 could significantly inhibit the levelsof COL1A1，PI3K and Akt （ Plt;0.05 ），reduce the proliferation，migration and invasion of gastric cancer cells，and increase the apoptosis rate （ Plt;0. 05 ）．After the addition of COL1A1 plasmid，PI3K and Akt expression increased（ Plt; 0.05），andtheanticancereffectof miR-1184 wasreversed；aftertheaditionof si-PI3K，theproliferation，migrationand invasiveness of gastric cancercells reduced significantly，and theproportion of apoptosis increased significantly（ Plt;0.05 ）. ConclusionLow expresion of miR-1184 in gastriccancerand its mechanism of actionvia regulation ofCOL1A1to influencePI3K/Aktsignalingpathway，overexpressionofmiR-1184markedlyinhibitsgastriccancercellproliferation，migration， and invasion，and increase the rate of apoptosis.

【Keywords】miR-1184；collagen type I alpha 1（COL1A1）； PI3K/Akt; gastric cancer;cellfunction

胃癌是全球范圍內常見的惡性腫瘤之一，其發病率和病死率均居高不下[1]。盡管近年來在胃癌的早期診斷和治療方面取得了一定進展[2]，但由于其發生發展過程受多種分子機制調控，現有治療手段仍存在諸多局限，亟需深入探索新的有效靶點以提升治療效果。微小RNA（microRNA，miRNA）是一類小分子非編碼RNA，可通過靶向靶基因的3非翻譯區（3UTR），調控基因轉錄后的表達情況。研究表明，miRNA在多種腫瘤的發生發展中起著重要作用[3-4]，其中miR-1184 作為一種潛在的抑癌基因受到了廣泛關注。

I型膠原α1鏈（COL1A1）是一種編碼I型膠原蛋白 α_α1 鏈的基因，I型膠原蛋白是細胞外基質的主要成分之一，可參與調控細胞黏附、遷移及組織修復等生理進程。在肺腺癌中，COL1A1的異常高表達與腫瘤的侵襲、轉移及不良預后顯著相關[5]。PI3K-Akt通路作為細胞內關鍵調控網絡，其介導細胞增殖、代謝重編程及凋亡抵抗過程，PI3K-Akt信號通路的強化會促進腫瘤細胞獲得無限增殖能力、代謝適應及免疫逃逸特性[6]

本研究從表達模式、功能驗證及信號通路調控三個層面，系統探討了miR-1184在胃癌中的潛在作用機制，通過分析miR-1184在胃癌中的表達特征，揭示了其在胃癌發生發展中的潛在作用機制，為胃癌臨床轉化應用提供理論支持。

1 對象與方法

1.1患者與樣本采集2022年10月—2023年8月齊齊哈爾醫學院附屬第二醫院普外科接受手術切除的原發性胃癌患者的部分癌組織（30例）和配對癌旁組織（30例）樣本。患者一般資料如表1所示。

患者納入標準：（1）病理學確診為胃癌；（2）年齡 ?18 歲；（3）患者精神及認知功能正常；（4）臨床病歷資料完整。

排除標準：（1）接受過任何形式的抗腫瘤治療；（2）既往5年內確診其他惡性腫瘤；（3）女性患者處于妊娠期、哺乳期或計劃妊娠;（4）合并不可控的器官衰竭。

表1患者一般資料 （n，%）

注：轉移患者中各部位占比（ n=28 ）

1.2實驗試劑及儀器兩性霉素B和青霉素-鏈霉素均購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，HBSS緩沖液購于北京百奧萊博科技有限公司，膠原酶、BrdU試劑盒均購于美國Sigma-Aldrich公司，LipofectamineTM 3000 購于美國 Thermo Fisher Scientific 公司，PrimerScriptRT試劑盒購于日本Takara公司，Matrigel基質膠、Transwell小室均購于美國Corning公司，AnnexinV/PI凋亡檢測試劑盒購于美國BDPharmingen公司。流式細胞儀型號為BDFACSCali-bur，倒置顯微鏡型號為NikonEclipseTi2，離心機型號為Eppendorf 5810R，生物安全柜型號為ThermoScientificHerasafeKS。

1.3細胞培養將采集的胃癌組織及配對癌旁組織浸入含 2.5μg/mL 兩性霉素B和 100U/mL 青霉素-鏈霉素的HBSS緩沖液中低溫保存。在生物安全柜中，用預冷HBSS緩沖液反復沖洗組織3次，去除殘留血液及壞死組織部位。保留直徑 ?0.5cm 的實體腫瘤區域，用眼科剪將組織剪碎，膠原酶酶解，過濾、離心后培養于RPMI-1640完全培養基中，于37%5% CO₂ 條件下進行細胞貼壁培養。培養 24h后進行細胞換液。

1.4細胞轉染將胃癌細胞以 5×10⁵ 個細胞/孔的密度接種在6孔板中，并在 37^°C 下培養過夜，隨后用 LipofectamineTM 300O 將對照 siRNA（si-NC 組）、miR-1184質粒（miR-1184組）、miR-1184質粒和COL1A1質粒（ 'miR-1184+COL1A1 組）miR-1184質粒和COL1A1質粒及si-PI3K質粒（ miR-1184+ COL1A1 + si-PI3K組）轉染至細胞。另設置對照組，不進行轉染。在轉染后 ^48h ，通過RT-qPCR檢測細胞中miR-1184、COL1A1、PI3K和AktmRNA表達，確定基因沉默的影響。

1.5RT-qPCR總RNA 使用FreeZol Reagent 200rxns 進行分離，并用PrimerScriptRT試劑盒將總RNA合成cDNA，使用miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒逆轉錄來自總RNA 的 miRNA。使用 SYBR green Premix Ex TaqⅡ熒光定量試劑盒在ABIPrism R 7500型RT-qPCR儀上進行擴增。 β -actin和U6分別用作mRNA和miRNA表達水平的內源性對照。使用 2^ΔΔCt 方法計算目的基因相對表達量。引物系列見表2。

表2引物序列

1.6細胞增殖按照BrdU試劑盒檢測胃癌細胞增殖情況。用含 1% 胎牛血清的培養基饑餓細胞 24h 隨后加入 1μmol/L S1P作用 ^16h 以激活細胞增殖通路。終止前 8h 加人BrdU，隨后進行DNA變性、細胞固定及透化處理，使用 5% BSA-PBS溶液進行封閉操作，BrdU抗體（ 1：200 室溫孵育 ^2h ，洗滌3次后，進行HRP標記的二抗（ 1：2000 孵育 ¹h TMB顯色 20min 后立即加入終止液于分光光度計下進行檢測、記錄與計算。

1.7細胞遷移和侵襲于Transwell中預涂或不預涂Matrigel基質膠，用于檢測胃癌細胞的遷移和侵襲能力。轉染 ^48h 后，用無血清培養基饑餓處理胃癌細胞，并接種到預涂或未預涂Matrigel的Tran-swell小室上腔，在下腔中加人 600μL 含 10% FBS的RPMI1640培養基。培養 ^48h 后，去除上腔中殘留的細胞。 4% 甲醛固定、 .0.1% 結晶紫染色。使用倒置顯微鏡（Nikon，日本）在5個隨機視野中計數遷移和侵襲的細胞。

1.8細胞凋亡取胃癌細胞用PBS重復洗滌2次。每管加人 2.5μL 的AnnexinV及 2.5μL 的Propidi-umIodide，混勻，避光 20°C 孵育 15min 。每管加入1mLPBS，1500轉離心 5min ，重復洗滌兩次后使用流式細胞儀分析以確定凋亡百分比。

1.9統計學方法 計數資料采用例數 （n） 表示，連續變量以平均值 ± 標準差 表示；配對設計資料，根據差值正態性選擇配對 χ_t 檢驗。統計分析使用SPSS22.0軟件。Tukey檢驗用于事后多重比較;相關性分析選擇Pearson線性相關性分析；多組間計量資料的比較使用單因素方差分析。檢驗水準： α= 0.05，雙側檢驗。

2結果

2.1miR-1184、COL1A1和PI3K/Akt在胃癌患者中的表達及關系通過RT-qPCR檢測胃癌組織和癌旁組織樣本中miR-1184、COL1A1、PI3K和Akt的mRNA表達水平的差異。結果顯示，胃癌組織中miR-1184表達量顯著低于癌旁組織，而COL1A1、PI3K和Akt表達顯著高于癌旁組織（ Plt;0. 001 。見表3。進一步對其表達水平進行相關性分析，由于PI3K/Akt作為經典通路，此處只分析上游基因PI3K的相關性。結果提示miR-1184與COL1A1表達呈顯著負相關（ ， Plt;0. 001 ），PI3K與COL1A1表達呈顯著正相關（ ，PI3K與miR-1184表達呈顯著負相關（ Δr=-0.?966 Plt;0. 001 ）。見圖1。這些結果提示，miR-1184、COL1A1和PI3K/Akt之間存在一定聯系，可能影響著胃癌細胞的發展。

表3miR-1184、COL1A1、PI3K和Akt在胃癌患者中的表達

：（A）miR-1184與COL1A1呈負相關;（B）PI3K與COL1A1呈正相關;（C）PI3K與miR-1184呈負相關圖1胃癌組織中miR-1184、COL1A1和PI3K表達水平的相關性

2.2miR-1184水平對COL1A1和PI3K/Akt表達的影響與對照siRNA 組相比，miR-1184質粒組miR-1184水平顯著升高，COL1A1、PI3K、Akt水平顯著降低（ （Plt;0，05） ；與miR-1184質粒組相比， miR-1184+ COL1A1質粒組COL1A1、PI3K、Akt水平顯著升高0 （Plt;0.05） ，與 miR-1184+COL1A1 質粒組相比，miR-1184+COL1A1+si-F I3K組PI3K、Akt水平顯著降低（Plt;0.05） 。見圖2A-D。表明miR-1184位于COL1A1上游，負調控COL1A1水平，而COL1A1位于PI3K/Akt上游，正調控PI3K/Akt的表達。

2.3miR-1184水平對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響與對照siRNA組相比，miR-1184質粒組胃癌細胞增殖活性、細胞遷移率與侵襲數顯著降低，細胞凋亡率顯著增加（ ?Plt;0.05） ；加入COL1A1質粒后，逆轉了miR-1184質粒組的整體趨勢（ Plt;0.05） ；加入si-PI3K后，與miR-1184+COL1A1質粒組相比，細胞增殖活性、細胞遷移率與侵襲數顯著下調，細胞凋亡率顯著增加（ Plt;0.05， 。見圖3A-D。表明miR-1184通過COL1A1作用于PI3K/Akt通路，對胃癌細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲有顯著影響。

注：（A）通過RT-qPCR 檢測 miR-1184水平;（B）通過RT-qPCR 檢測 COL1A1水平;（C）通過RT-qPCR 檢測PI3K水平;（D）通過RT-qPCR檢測 Akt 水平。 ns ：差異無統計學意義；與對照siRNA組比較， ·與miR-1184質粒組比較， ^#Plt;0.05 ；與 miR-1184+COL1A1 質粒組比較， 圖2miR-1184水平對COL1A1和PI3K/Akt表達的影響

注：（A）通過BrdU 檢測細胞增殖活力;（B）通過流式細胞儀檢測細胞凋亡率；（C-D）通過Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力；ns：差異無統計學意義；與對照siRNA組比較， ^**Plt;0.01 ;與miR-1184質粒組比較， ^#Plt;0.05 ；與 miR-l184+ COL1A1質粒組比較， ^gPlt;0.05 圖3miR-1184水平對胃癌細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲的影響

3討論

miRNAs作為一類參與腫瘤調控的調節因子，通過執行多種功能影響腫瘤進展，包括細胞分裂、細胞分化、血管生成、遷移、凋亡和致癌作用[7]。例如，通過直接與PTEN結合，miR-381可能增加胃癌細胞的增殖、侵襲和遷移[8]。此外， miR-32-5p 可以通過激活PI3K/Akt通路促進胃癌進展[9]。同時，也有研究發現miR-1184可靶向CSNK2A1抑制結直腸癌增殖與凋亡[10]。在我們之前的研究中，通過構建cir-cRNA-miRNA-mRNA（CMM）網絡和蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡，發現miR-1184在調控腫瘤進展中起著關鍵作用[1]。然而，miR-1184在胃癌中的機制尚不清楚。

本研究通過對胃癌組織和癌旁組織中miR-1184、COL1A1、PI3K和Akt的表達水平進行測定，發現miR-1184在胃癌組織中的表達顯著低于癌旁組織，而COL1A1、PI3K和Akt的表達則顯著高于癌旁組織。相關性分析顯示，miR-1184與COL1A1表達呈顯著負相關，PI3K與COL1A1表達呈顯著正相關，PI3K與miR-1184表達呈顯著負相關。這些結果表明，miR-1184、COL1A1和PI3K/Akt之間存在一定的聯系。

通過細胞實驗發現，miR-1184的過表達能夠顯著抑制COL1A1、PI3K和Akt的表達，并減少胃癌細胞的增殖、遷移和侵襲，同時增加細胞凋亡率。這些結果與先前文獻報道一致，表明miR-1184在胃癌中發揮抑癌作用。例如，徐順等[12]發現miR-1184在肝癌中的表達下調，并通過靶向胰島素樣生長因子結合蛋白4抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲。張小莉等[3]也報道了miR-1184在胃癌中的低表達。當加入COL1A1質粒后，上述效果被逆轉；而在加入si-PI3K后，胃癌細胞增殖、遷移與侵襲率顯著下調，細胞凋亡率顯著上調。這些結果進一步證實了miR-1184通過調控COL1A1來影響PI3K/Akt信號通路，從而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲與凋亡。

盡管本研究揭示了miR-1184通過調控COL1A1影響PI3K/Akt信號通路，從而抑制胃癌細胞的增殖、侵襲與凋亡，但仍存在一些局限性：本研究僅納入了30例胃癌患者的樣本，樣本量較小，可能無法完全代表所有胃癌患者的情況。未來需要擴大樣本量，進行多中心、大樣本的研究，以提高結果的普遍適用性。本研究部分機制主要基于細胞實驗，缺少體內動物模型功能驗證。未來應進一步開展體內實驗，以驗證miR-1184在活體中的抑癌作用。雖然初步揭示了miR-1184通過調控COL1A1影響PI3K/Akt信號通路的作用機制，但具體調控的分子機制仍需進一步探索，以更全面地理解miR-1184在胃癌中的作用機制。

綜上所述，miR-1184在胃部惡性腫瘤組織中呈現顯著表達水平下調的特征。進一步分子機制研究證實，該microRNA通過靶向調控膠原蛋白合成關鍵因子COL1A1，進而干預PI3K/Akt級聯信號傳導網絡的活化狀態。值得注意的是，體外功能實驗顯示，過表達miR-1184可明顯削弱胃癌細胞的增殖，并有效阻滯其遷移侵襲等惡性表型，同時顯著誘導腫瘤細胞程序性死亡。從轉化醫學角度分析，本研究不僅拓展了對胃癌病理進程中表觀遺傳調控網絡的認識維度，更為重要的是為臨床早期診斷提供了新型分子標志物參考，并為開發基于microRNA調控的精準治療策略奠定了實驗依據。

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（收稿日期：2025-02-25修回日期：2025-05-27）（編輯：潘明志）

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