D-異抗壞血酸對亞硝酸鈉抑菌及發色效果的影響及其機制

Abstract：Thisstudy investigated theimpactsofdifferent D -isoascorbic acid concentrations （0， 0.01， 0.03，0.05，0.08，and 0.12g/100mL ）onthemeatcolor fixationeffectandantibacterialactivityof sodiumnitrite （NaNO₂） .Theresultsindicated that the presence of D -isoascorbic acid promoted the decomposition of NaNO₂ ，this effect being more pronounced at higher concentrations. D -isoascorbic acid at 0.08g/100mL exhibited potent inhibitory effect against Staphylococcus aureus， increasing the production of intracelular reactive oxygen species （ROS）and simultaneously enhancing cellular membrane permeability.The antibacterial effectof NaNO₂ was weakened by D -isoascorbic acid in the concentration range of （2號 0.01-0.03g/100mL .When D -isoascorbicacid concentration increased from O.08 to 0.12g/100mL ，theantibacterialeffect did notsignificantlychange，butadverse efectsontheformationof nitrosomyoglobin（NOMb）and myoglobinstability occurred. Therefore，when used as an adjuvant for NaNO₂ ，the concentration of D -isoascorbic acid shouldbe considered based on various indicators.

Keywords： sodium nitrite; D -isoascorbic acid; myoglobin; color fixation;antibacterial agent

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20250125-021

中圖分類號：TS201.2 文獻標志碼：A 文章編號：1001-8123（2025）10-0001-09

硝酸鹽和亞硝酸鹽對食品領域最突出的貢獻是對肉制品的保鮮作用[1]。首先，硝酸鹽和亞硝酸鹽可以抑制一些致病菌的生長，包括單核細胞增生李斯特菌（Listeriamonocytogenes）、蠟樣芽孢桿菌（Bacilluscereus）、金黃色葡萄球菌（Staphyloccocusaureus）及肉毒梭狀芽孢桿菌（Clostridiumbotulinum）等[2-4]。此外，硝酸鹽和亞硝酸鹽還可以穩定肉制品的色澤、改善肉制品的風味以及減緩脂質、蛋白質的氧化等[]。盡管相關研究[5-8]報道了硝酸鹽和亞硝酸鹽潛在的致癌風險，但是鑒于其對肉制品發揮的多重作用，尤其是對能夠產生劇烈毒素的C.botulinum的抑制作用，使其成為肉制品加工中不可被完全替代的一類食品添加劑。如Lebrun等最近的研究表明，加工肉制品中缺乏硝酸鹽或亞硝酸鹽將導致C.botulinum的生長和毒素的產生。

近些年來，研究人員逐漸發現還原劑可以通過將亞硝化劑還原為N/一氧化氮（NO）或者清除亞硝離子降低亞硝酸鹽的殘留并減少亞硝胺在人體中的合成，即還原劑能與前體胺競爭亞硝化劑[10-13]。美國食品藥品監督管理局也特別提到了使用抗壞血酸和 a -生育酚抑制N. -亞硝胺的形成[14-15]。此外，還原劑還有助于肉制品發色。肉類腌制過程中，氧合肌紅蛋白（oxymyoglobin，OMb）首先轉變為脫氧肌紅蛋白（deoxymyoglobin，DeoMb），而其可以作為亞硝酸鈉（sodiumnitrite，NaNO₂ ）的還原酶，產生高鐵肌紅蛋白（metmyoglobin，MMb）和NO，NO再與MMb中Fe3+反應形成亞硝酰高鐵肌紅蛋白復合物，隨后該復合物再被抗壞血酸等還原劑還原為亞硝基肌紅蛋白（nitrosomyoglobin，NOMb），即賦予肉制品粉紅色的關鍵色素[16-18]。Sebranek等[19]將¹⁵N. -亞硝酸鹽用于腌制肉的研究中，結果發現，約有 15% 的 NaNO₂ 會與肌紅蛋白反應。同時，也有研究證實抗壞血酸這類還原劑將會增加過氧亞硝基陰離子/過氧亞硝酸（ONOO/ONOOH）的合成，促進 NaNO₂ 的抗菌活性[20]。但關于 ??D. -異抗壞血酸如何影響 NaNO₂ 對肉的抑菌及發色雙重作用的研究鮮見報道。鑒于 ??D. -異抗壞血酸相較于抗壞血酸而言更穩定、價格更低等優勢，本研究為了同時探究 D -異抗壞血酸對 ΔNaNO₂ 抑菌和發色兩方面的影響，將肌紅蛋白和 NaNO₂ 加入溶液體系，以S.aureus作為受試菌，測定不同 D -異抗壞血酸質量濃度（0、0.01、0.03、0.05、0.08、 0.12g/100mL ）對溶液pH值、菌落總數、菌體內活性氧（reactive oxygen species，ROS）、細胞膜通透性、細菌形態、發色物質含量及亞硝酸鹽殘留量的影響，旨在為還原劑如何促進 NaNO₂ 發揮作用提供理論及數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（S.aureusACCC11559）購自中國農業微生物菌種保藏中心。

NaNO₂ 、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鹽酸萘乙二胺天津市大茂化學試劑廠；肌紅蛋白（純度 95%～100% ）北京索萊寶生物科技有限公司； D -異抗壞血酸、戊二醛 2.5g/100mL ）、對氨基苯磺酸上海麥克林生化科技股份有限公司；平板計數瓊脂（platecountagar，PCA）、LB（Luria-Bertani）肉湯培養基青島高科技工業園海博生物技術有限公司；ROS檢測試劑盒（含^2′，7′ -二氯二氫熒光素二乙酸酯（ ^2′，7′ -dichlorodihydrofluoresceindiacetate，DCFH-DA）探針）碧云天生物技術有限公司；碘化丙啶（propidiumiodide，PI）染色試劑盒生工生物工程（上海）股份有限公司；無水乙醇、氯化鈉、濃鹽酸天津市江天化工技術股份有限公司。所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FE28pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；FlexA-200HT酶聯免疫分析儀杭州奧盛儀器有限公司；BX53正置熒光顯微鏡 日本奧林巴斯公司；UV3600Plus紫外分光光度計 日本島津公司；Infinite200Pro熒光酶標儀帝肯奧地利有限責任公司；SU3800掃描電子顯微鏡（scanningelectron microscope，SEM）日本Hitachi公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

1.3.1.1 菌種活化及培養

采用劃線法將凍存于 -80^°C 的S.aureus接種于PCA平板上進行活化，于 37°C 恒溫培養箱中倒置培養 ^48h 。隨后選取生長良好的S.aureus單菌落，接種于滅菌的LB肉湯培養基中，于 37°C 、 200r/min 培養 12h 。從中吸取1mL 混合均勻的菌液于含 100mL LB肉湯的錐形瓶中，繼續培養 ^;4h 。從而獲得處于對數生長中期的S.aureus。經 8 000×g 、 4^°C 離心 5min 收集菌體沉淀，并使用無菌 0.85g/100mL NaC1溶液洗滌菌體3次。將菌體沉淀重懸于 0.85g/100mL NaC1溶液中，用紫外分光光度計調節菌液濃度至約 10⁸CFU/mL ，即 OD_600nm=0.2 （約為4×10⁸CFU/mL ）。稀釋得到濃度為 4×10⁴ CFU/mL的菌懸液，置于 4^°C 冷藏備用。

1.3.1.2 溶液體系制備

滅菌后的離心管中各加入無菌LB液體培養基C pH5.6 ） 1.25mL ，依次再吸入溶解于磷酸鹽緩沖液（phosphatebufferedsaline，PBS）（ pH5.6 ）的肌紅蛋白、 NaNO₂ 、 D -異抗壞血酸溶液及S.aureus菌懸液，使肌紅蛋白質量濃度為 1mg/mL ， ΔNaNO₂ 質量濃度為0.1mg/mL ， D -異抗壞血酸質量濃度依次為0（對照）、0.01、0.03、0.05、0.08、 0.12g/100mL ，菌濃度為2×10³CFU/mL ，各溶液體系體積保持一致。

1.3.2 pH值測定

分別于溶液反應的0、1、8、16、32、48h取樣，用pH計進行測定，將電極浸入被測溶液中，待讀數穩定后記錄pH值。每個樣品進行3次重復測定，結果取平均值。

1.3.3 抑菌效果評估

1.3.3.1 S.aureus菌落總數測定

分別于溶液反應的0、1、8、16、32、48h取樣，于超凈工作臺中準確吸取 1mL 液體樣品，加入 9mL 無菌 0.85g/100mL NaC1溶液稀釋得到1：10的勻液，以此類推進行稀釋。不同時間點分別吸取 100μL 不同濃度的勻液均勻涂布于PCA培養基，同時吸取無菌0.85g/100mLNaCl 溶液作為空白對照，所有培養皿均倒置于 37^°C 恒溫培養箱中培養48h后計數。

1.3.3.2 S.aureus中ROS測定

溶液反應48h時取樣。配制 DCFH-DA探針溶液。將 1mL 樣品以 8000×g ！ 4^°C 離心 10min ，棄去上清液，用PBS（ pH7.2 ）緩慢清洗2次，每次靜置 1min 0加入 300μL DCFH-DA探針溶液完全覆蓋沉淀，混勻，并置于 37°C 避光孵育 30min 。再次離心（ 8000×g 、4°C ），棄上清，用PBS緩慢清洗2次，每次靜置 1min 。重懸于 0.5mL PBS（ pH7.2） ，取 菌懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察熒光分布，判斷細菌氧化損傷程度。同時取 1mL 樣品調整 ΔOD_600，nm 約為0.1，再吸取 200μL 用酶標儀測定樣品的熒光強度（激發波長 488nm 、發射波長 525nm ），ROS水平用熒光強度表示。

1.3.3.3 S.aureus細胞膜通透性測定

溶液反應48h時取樣。S.aureus細胞膜通透性的測定使用PI染色試劑盒（含 1× 分析緩沖液）。將 1mL 樣品以 8000×g ， 4°C 離心 10min ，棄去上清液，沉淀用PBS（ pH7.2 ）緩慢清洗2次，每次靜置 1min 。重懸于 1× 分析緩沖液并調整 OD_600nm 約為0.1。吸取 190μL 菌懸液，加入 10μL PI染色液（ ）， 37^°C 避光孵育 20min 。吸取 .5μL 菌懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片后用熒光顯微鏡觀察熒光分布，確認細菌細胞膜的完整性。同時取200μL 樣品用酶標儀測定熒光強度（激發波長 535nm 發射波長 615nm ），以熒光強度（PI水平）表示受損細菌含量。

1.3.3.4 S.aureus形態學觀察

溶液反應48h時取樣觀察。將 1mL 樣品于 8000×g. 4℃離心 ?5min ，棄去上清液，沉淀用PBS（ pH7.2 ）清洗2次，每次 1min 。用 2.5g/100mL 戊二醛于 4^°C 固定^5h ，確保細菌濃度大于 10⁸CFU/mL ，再次用PBS清洗2次，每次 1min ，用不同體積分數（ 30% 、 50% 、 70% 、80% 、 90% ）的乙醇溶液及無水乙醇進行脫水處理，每個梯度脫水 15min ，以避免細胞收縮。最后再將細菌懸浮于無水乙醇中，吸取 .5μL 菌懸液滴到單晶硅片上，干燥后用導電膠將樣品粘在樣品臺上，氬氣環境噴金 3min 后用SEM觀察S.aureus形態（加速電壓 5.0kV 、放大倍數10000倍）。

1.3.4 肌紅蛋白及其衍生物測定

1.3.4.1 肌紅蛋白紫外-可見吸收光譜測定

分別于溶液反應的0、1、16、32、 ^48h 取樣。將500μL 樣品以 8000×g 人 4°C 離心 5min ，取 200μL 上清液用酶聯免疫分析儀測定肌紅蛋白于 350～700nm 處的紫外-可見吸收光譜。

1.3.4.2 NOMb含量測定

分別于溶液反應的0、1、16、32、48h取樣。將500μL 樣品以 8000×g 、 4^°C 離心 ?5min ，取 200μL 上清液用酶聯免疫分析儀測定 540nm 處的吸光度 （A_540nm） ）。NOMb含量以每升血紅素中NOMb含量表示，按式（1）[21]計算：

NOMb含量/（mg/L）=290×A540 mm

1.3.4.3 肌紅蛋白相對含量測定

參考Zajac等[22的方法。分別于溶液反應的0、1、16、32、48h取樣。將 500μL 樣品以 8000×g ， 4°C 離心5min ，取 200μL 上清液用酶標儀測定525、545、565、572nm 處的吸光度。DeoMb、OMb、MMb相對含量分別按式 （2）～（4） 進行計算：

DeoMb相對含量 /9%=（0.369X₁+1.140X₂-0.941X₃+ 0.015） ×100 （2）

OMb相對含量 1%=（0.882X₁-1.267X₂+0.809X₃- 0.361） ×100 （3）

MMb相對含量 1%=（-2.514X₁+0.777X₂+0.8X₃+ 1.098） ×100 （4）

式中： X₁=A_572nm/A_525nm X₂=A_565nm/A_525nm X₃= A_545nm/A_525nm^°

1.3.5 亞硝酸鹽殘留量測定

分別于溶液反應的0、1、16、32、48h取樣。使用分光光度法測定樣品中亞硝酸鹽殘留量[23]。

1.4 數據處理

所有實驗均重復3次，結果以平均值±標準差表示。采用SPSS12.0軟件的單因素方差分析中的Duncan's多重比較對數據進行統計分析， Plt;0.05 被認為數據之間存在顯著差異。通過Origin2021b軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 D -異抗壞血酸對體系pH值的影響

如圖1所示，反應前期體系的pH值隨著 D -異抗壞血酸添加量的增加呈下降趨勢。 D -異抗壞血酸能在溶液中釋放 H⁺ ，從而表現出酸性，當添加量增加時， H⁺ 相應增加，因此 D -異抗壞血酸添加量越多，體系pH值越低。當體系反應到16h后， D -異抗壞血酸添加量為0.01、0.03g/100mL 時的pH值與對照組無明顯差異，甚至高于對照組。這可能是由于生長后期隨著體系中營養物質的消耗，S.aureus生長代謝對pH值有顯著影響，產生了更多堿性代謝物，導致pH值上升[24]。

且添加量越高，在同一時間產生的NO越多，相應地，對細菌的抑制效果越好。

然而，隨著反應的進行， D -異抗壞血酸添加量為0.01、 0.03g/100mL 的2組中菌落總數幾乎均顯著高于其他組，且添加量為0.05、0.08、 0.12g/100mL 的體系中所測得的菌落總數相比于對照組始終保持在較低水平，這一效果在0.08、 0.12g/100mL 的體系中更顯著，且二者無顯著差異。當 D_δ -異抗壞血酸添加量較低時 （0.01g/100mL ），其通過加速 NaNO₂ 的消耗速率而降低了 NaNO₂ 的抗菌效果，同時這一作用也可能間接調節了體系中的RONS水平，特別是減少了可能由過量亞硝酸鹽轉化而來的有害產物，如NO和ONOO/ONOOH的生成，從而在某種程度上緩解了氧化應激對細菌細胞的過度損傷。而當 D -異抗壞血酸添加量足夠多時，即使 NaNO₂ 被還原，在前期釋放大量NO的基礎上，仍有大量的 D. -異抗壞血酸通過產生ROS和影響細胞膜的通透性進而發揮更強烈的抑菌效果。因而 0.08g/100mL 與0.12g/100mL 添加組之間始終無顯著差異，即D-異抗壞血酸添加量達到 |0.08g/100mI 時即可表現出較好的抑菌效果。

2.2 D -異抗壞血酸對 NaNO₂ 抑菌效果的影響

2.2.1 S.aureus菌落總數分析

如圖2所示，在反應剛開始時，各組之間菌落總數無顯著差異。當體系反應1h時，對照組菌落總數最多，而D-異抗壞血酸的加入降低了菌落總數，并且D-異抗壞血酸的添加量越高，菌落總數越低。一般來說，體系中的DeoMb會與 NaNO₂ 發生反應，結合生成NO，這一過程會在抗壞血酸這類還原劑的存在下得到促進[25。值得注意的是，這類還原劑不僅直接參與這一還原反應，還間接參與了高鐵肌紅蛋白還原酶的還原循環，這一循環對于維持體系中NO、超氧陰離子自由基（·O₂^- ）、過氧化氫（ H₂O₂ ）以及ONOO/ONOOH等活性氧和活性氮（reactive oxygenand nitrogen species，RONS）的動態平衡至關重要[25-26]。ONOO?/ONOOH作為RONS中的強氧化劑，其存在顯著增加了體系的氧化應激水平。這種高度的氧化應激環境極易導致DNA、蛋白質及其他生物大分子發生氧化和硝化損傷，這些損傷累積到一定程度就會觸發一系列細胞內的應激反應，最終導致細菌細胞的結構和功能受損，甚至引發細胞死亡[20.27]。因此，反應初期，添加的D-異抗壞血酸加快了NaNO2產生NO的速率。

2.2.2 S.aureus菌體ROS水平分析

ROS指的是 H₂O₂ 、羥自由基（·OH）、 ?_O2^- 、ONOO-等過氧化物的總稱[28]。ROS失衡會造成菌體氧化應激損傷或死亡[29]。在酸性條件下， Fe²⁺ 可以作為催化劑分解 H₂O₂ ，產生反應活性較強的·OH，破壞細菌細胞，而導致菌體死亡，這一反應被稱為Fenton氧化[30]。但·OH半衰期極短（水溶液中為 10^-9s ），作用效果有限。因而衍生出類Fenton氧化，即過渡金屬離子與有機酸產生·OH的過程[31。本實驗體系中 D. 異抗壞血酸與鐵離子的反應則屬于這類氧化反應。因此體系在反應48h后可以通過熒光顯微鏡觀察到綠色熒光的產生，且 D_δ -異抗壞血酸的添加量為 10.05，0.08，0.12g/100mL 時產生的綠色熒光強度最強，其余幾組產生的綠色熒光則相對較弱（圖3A）。在整個過程中， O₂ 分子與 D. -異抗壞血酸通過細菌的細胞膜不斷進入細胞內，與細胞中的鐵離子發生類Fenton反應，產生足以破壞細胞膜脂類成分、DNA和蛋白質的ROS。與此同時，更高濃度的D-異抗壞血酸促進 NaNO₂ 更快分解，使之更快地形成ONOO和NO。

圖3不同質量濃度D-異抗壞血酸處理48h后S.aureus中ROS 熒光圖像（A）及菌體內ROS水平（B） Fig.3Fluorescence images （A） and ROSlevels（B） inS.aureusafter 48hoftreatmentwithdifferentconcentrationsof D -isoascorbicacid

由圖3B可知，各組的熒光強度大小依次為0.08g/100mL 組（507.00） gt;0.12g/100mL 組 （506.00）gt; 0.03g/100mL 組（469.33） gt; 對照組（ 467.67）gt; 0.05g/100mL 組 組（326.00），表明低質量濃度的 D -異抗壞血酸會降低NaNO₂ 誘導ROS的生成，且除了 NaNO₂ 本身的作用之外，過量的 D -異抗壞血酸加入后，將會誘導細菌產生更多的ROS。Majou等[2的研究也表明抗壞血酸會增加ONOO ONOOH的產生，增強細菌氧化應激，進而促進抑菌活性。

2.2.3 S.aureus菌體細胞膜通透性分析

PI是一種極為有效的熒光染料，其獨特的性質在于它能夠特異性地與雙鏈DNA緊密結合，并在結合后釋放出強烈的熒光信號[32]。值得注意的是，PI分子本身并不具備穿透活細胞膜的能力，它僅僅能夠滲透到那些細胞膜已經受損或是已經死亡的細胞中[33]。如圖4A所示，幾乎所有體系均呈現出紅色熒光，其中D-異抗壞血酸添加量為0.05、0.08、 0.12g/100mL 的體系所表現出的紅色熒光較強，這表明雖然還原劑的添加會加速 NaNO₂ 的分解，進而影響 NaNO₂ 的抑菌效果，但是這種效應的出現似乎有一個限定條件，即較低的D-異抗壞血酸添加量。當 D -異抗壞血酸添加量足夠高時， D -異抗壞血酸除了促進 NaNO₂ 分解之外，自身也會影響S.aureus細胞膜通透性，使胞內物質泄漏，干擾細菌正常生長代謝，進而影響細菌細胞正常生理功能的運轉和抑制細菌的生長。

圖4不同質量濃度D-異抗壞血酸處理48h后S.aureusPI 熒光圖像（A）及菌體內PI水平（B） Fig.4Propidium iodide-stained fluorescence images （A） and intensity （B）of S.aureusafter 48h of treatment withdifferentconcentrations of D -isoascorbic acid

由圖4B可知，各組的熒光強度大小依次為0.12g/100mL 組（5035.67） gt;0.08g/100mL 組（5005.33） gt;0.05g/100mL 組 （4065.00）gt; 對照組 （3859.00）gt;0.03g/100mL 組 （3565.67）gt; 0.01g/100mL 組（3510.00）。因此， D. 異抗壞血酸添加量0.01、 0.03g/100mL 組與對照組相比對細胞膜的破壞較弱，0.05、0.08、 0.12g/100mL 添加量組則表現出相反的結果，增加了細胞膜的通透性。

2.2.4 S.aureus形態分析

為了更清晰地觀察不同濃度 D -異抗壞血酸對細菌細胞壁膜的影響，通過SEM對經48h處理的菌體樣本進行形態分析。如圖5所示，經 0.01g/100mLD -異抗壞血酸處理后的S.aureus形態較為光滑、飽滿，呈現出較為典型的葡萄球狀。與之差異最大的是 D. -異抗壞血酸添加量0.08、 0.12g/100mL 組，其細胞膜周圍伴有黏性物質，呈黏連狀態，且菌體幾乎溶解、細胞膜有明顯褶皺和凹陷，失去細胞基本結構。其余3組菌體變化雖不及這2組，但是菌體形態也發生一定程度的改變，細胞膜周圍伴有黏性物質，呈黏連狀態，少部分菌體凹陷。由此推測，除了 NaNO₂ 會破壞細胞結構之外， D -異抗壞血酸加入后，也會促進菌體內營養成分的外泄，導致細胞表面粗糙度增加、黏連物質積累及細胞膜褶皺的形成。

A～F.D-異抗壞血酸添加量依次為0、0.01、0.03、0.05、0.08、0.12g/100mL

圖5 不同質量濃度D-異抗壞血酸處理48h后S.aureusSEM圖像 Fig.5 ScanningelectronmicroscopeimagesofS.aureusafter 48h treatmentwithdifferentconcentrationsof D -isoascorbicacid

2.3 D -異抗壞血酸對 NaNO₂ 發色效果的影響

2.3.1 肌紅蛋白紫外-可見吸收光譜

肌紅蛋白在可見光范圍內具有特定的吸收光譜，這一特性主要源于其分子中的血紅素輔基。血紅素輔基內的卟啉環有較強的紫外-可見吸收度，且具有選擇性，只吸收特定波長的光[34]。如圖6所示，反應1h時，對照組和添加 0.01g/100mLD -異抗壞血酸的樣品在 504nm 和 631nm 附近處展現出明顯吸收峰。血紅素輔基中Fe2+被氧化成 Fe³⁺ 后，會在 505nm 和 630nm 處輕微升高，于550nm 處則表現出下降趨勢[22]，這表明MMb在此溶液中占據主導地位。隨著反應的持續進行，相較于 544nm 而言，各組在 582nm 處更陡峭的吸收峰表明OMb逐漸占據主導地位。這是因為OMb的特征吸收峰在 418～419nm 附近的Soret峰，以及 535～545nm 和 575～585nm 處的Q帶。加入 D -異抗壞血酸的體系表現出MMb的減少（500、 630nm ）和OMb的增加（544、 582nm ），且在530～600nm 處整體上轉變為更高的值。相反，于544、582nm 處表現較強吸收峰的樣品未在 504nm 處表現出可見吸收峰。但是這一方法不能精確地確定OMb和NOMb含量的差異，NOMb具有與前者相似的Q帶（548、579nm ），因此繼續測定各肌紅蛋白的含量。

2.3.2 NOMb含量

如圖7所示，除了 0.12g/100mLD -異抗壞血酸添加組之外，其余組的NOMb含量均隨反應時間延長呈現逐漸升高的趨勢。這說明一定濃度的 D -異抗壞血酸將促進NOMb的持續產生，而過量的 D_δ -異抗壞血酸將會促進NaNO₂ 更快還原為NO，但是呈色不穩定，后續表現出大幅下降的結果。對照組中未添加 D. -異抗壞血酸，因此整體上NOMb含量及產生速率相較于其他組較慢。 D. 異抗壞血酸則加快了 NaNO₂ 的分解速率，進而加快了 NaNO₂ 與肌紅蛋白的反應速率，以及NOMMb向NOMb的還原。但隨著反應的進行，NOMb的增加逐漸變緩。同時，從16h開始，D-異抗壞血酸添加量為 10.03～0.08g/100mL 時，各組之間產生的NOMb含量差異不顯著。

2.3.3 肌紅蛋白相對含量

當體系的pH值維持在 5.0～6.0 這一范圍時，抗壞血酸的加入能夠將MMb還原為亞鐵肌紅蛋白（MbFe2+，包含DeoMb和OMb）和脫氫抗壞血酸。這一還原過程中，不僅實現了MMb向MbFe+的轉變，還伴隨產生脫氫抗壞血酸，后者是抗壞血酸氧化后的產物[35]。如圖8所示，隨著反應時間延長，除了 0.12g/100mLD -異抗壞血酸添加組之外，其余各組的MMb相對含量整體均呈現下降趨勢， MbFe²⁺ 相對含量則整體呈現升高趨勢，且隨著D -異抗壞血酸添加量的增加，這一現象愈加明顯。說明在一定范圍內， D -異抗壞血酸的存在不僅可以促進NOMb的產生，還可以促進MMb向MbFe2+的還原[36]。當體系反應1h時，只有當 D -異抗壞血酸添加量較大時（0.08、 0.12g/100mL ），MMb相對含量才表現出較為顯著的下降趨勢，MbFe2+相對含量表現出顯著的上升趨勢，其余的幾組甚至未檢測到DeoMb的存在。當反應48h時， D -異抗壞血酸添加量為 10.03～0.08g/100mL 的體系未檢測到MMb的存在，表明大部分MMb已經被還原為MbFe2+，且此時對照組仍有近 90% 的MMb。0.12g/100mLD -異抗壞血酸添加組則由于還原劑添加量過高而促使 NaNO₂ 在反應初期便使NO大量釋放，因而后期出現MMb的大量積累。

2.4 D -異抗壞血酸對亞硝酸鹽殘留量的影響

如圖9所示，亞硝酸鹽殘留量隨時間的延長整體呈現下降趨勢。這是由于 NaNO₂ 被消耗，一部分以氣體形式溢出，一部分被降解，其余部分與蛋白質及金屬離子發生反應。 D -異抗壞血酸添加量為 0.01g/100 mL時與對照組無顯著差異，添加量為 10.12g/100mL 時所測得的殘留量最少。因此， D. -異抗壞血酸的加入可以顯著降低亞硝酸鹽的殘留量，且添加量越多，清除效果越明顯。分析其原因，可能是因為隨著 D. -異抗壞血酸濃度的升高，溶液pH值更低，溶液的還原性相應提高，此時還原劑的清除效果增強，加快了 NaNO₂ 被還原為NO的速率，維持了NO的產生[37-38]。

3結論

低添加量的 D -異抗壞血酸（ lt;0.03g/100mL ）會降低 NaNO₂ 的抑菌作用，高添加量的 D -異抗壞血酸 0.12g/100mL ）又將造成 NaNO₂ 較快分解，無法長時間發揮發色效果。適當添加量的 D -異抗壞血酸（ 0.08g/100mL ）可以通過促進MMb的還原和增加NOMb的產生促進 NaNO₂ 的發色作用，并且增加細菌細胞內ROS的產生和細胞膜通透性，從而引起細菌生物大分子氧化和硝化，增強 NaNO₂ 的抑菌作用，其中損傷細胞膜是 ?D -異抗壞血酸增強抑菌效果的重要方式。因此，在肉制品的實際應用中，應考慮 D -異抗壞血酸與 NaNO₂ 的添加比例，進而提升 ??D. -異抗壞血酸促進發色與抑菌的雙重效應。

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