KLF4在子癇前期患者胎盤及血清中的表達及臨床意義

Expressionandclinical significance ofKLF4 inplacenta and serum ofpatients withpreeclampsia

TANG Yi ^1，2 ，MENGQ i^1，3 ，XUYunzhao1，2 （Department of Obstetricsand Gynecology，Afiliated Hospital ofNantong University，Jiangsu ; 2Medical School of Nantong University; 3Dalian Medical University）

[Abstract]Objective：To explore therelationshipbetween Kruppel-like factor 4（KLF4）andthe developmentof preclampsia（PE），anditsclinical significance.Methods：Atotalof68patients withPEwereselected，including37cases of early-onset preeclampsia （EPE） （EPE group）and 31 cases of late-onset preclampsia （LPE）（LPE group）.Sixty normal pregnant women inthe third trimester of pregnancy were taken as theNP group.Theimmunohistochemistryand protein bloting method wereused todetect the expresionof KLF4in placentaltissues;theenzyme-linked immunosorbentassay （ELISA）wasusedtodetectthelevelofKLF4inperipheralbloodandumbilicalarteryblood，andPearsoncorrelationtest wasused to analyse the relationship between serum KLF4 level inthe patients with PEandthequantitative amount of 24 h urineprotein.Results：TherelativeexpressionlevelofKLF4 protein inplacentaltissuesof thePE group wasO.61±0.10， which waslower than O.98±0.11 of the NP group（ P lt;0.05）; the relative expression level of KLF4 protein in placental tissues of the EPE group was 0.34±0.09，which was lower than 0.67±0.12 of the LPE group（Plt;0.05）.The concentration of KLF4 in the peripheral'serum of the PE group was 1.78±0.09 ，which was lower than 1.85±0.08 of the NP group（ Plt; 0.05）；theconcentration of KLF4intheumbilicalarteryserum of thePE groupwas1.56±O.13，which was lower than 1.66±0.08 of the NP group （Plt;0.01） ； the correlation analysis showed a negative correlation between the level of KLF4 in the PE group and the quantitative amount of 24 h urine protein （r=-0.7150， P lt;0.001）.Conclusions： The expression of KLF4 isdecreased inplacental tisues，peripheralbloodandumbilicalartery bloodof PEpatients.Thelevelof KLF4 in peripheral serum isnegativelycorrelated withthe24hurine proteincontent，suggesting thatthelowexpressionofKLF4is related to the occurrence and development of preeclampsia.

[Key Words]preeclampsia；Kruppel-likefactor4；immunohistochemistry；protein bloting;enzyme-linked immunosorbent assay

子癇前期（preeclampsia，PE）是妊娠期婦女獨有的復雜產科并發癥，具有異質性、多系統性、進行性等特點。PE病理生理學機制尚不完全清楚，目前較為公認的兩大因素是胎盤形成不良和母胎免疫。Kruippel樣因子4（Kruppel-likefactors4，KLF4）是鋅指蛋白家族具有多功能結構域的蛋白，研究顯示在不同腫瘤的細胞微環境中，KLF4與不同靶基因結合，在腫瘤發展過程中發揮雙向調控作用。胎盤滋養細胞與腫瘤細胞特性相似，滋養細胞分化缺陷會引發子癇前期[3。推測KLF4在胎盤中異常表達可導致胎盤形成不良，同時介導母體免疫反應，進而使血管內皮功能受損，最終引發妊娠期高血壓疾病。本研究選擇2020年12月一2022年11月在我科住院分娩的68例PE患者，與妊娠晚期正常孕婦比較分娩前外周血及產時臍動脈血和胎盤組織中KLF4表達水平，為子癇前期診斷提供實驗室標志物，以降低發生不良妊娠的風險。

1資料與方法

1.1一般資料PE 患者68例中早發型子癇前期（early-onsetpreeclampsia，EPE）37例（EPE組），晚發型子癇前期（late-onset preeclampsia，LPE）31例（LPE組）。以同期在我科分娩的妊娠晚期正常孕婦60例為NP組。3組年齡、流產次數、妊娠次數比較，差異均無統計學意義（ Pgt;0.05 ）;3組體質量指數（bodymassindex，BMI）、初診孕周、終止孕周、1分鐘及5分鐘Apgar評分、新生兒體質量及新生兒轉科率比較，差異均有統計學意義 （Plt;0.05） ;EPE組、LPE組BMI大于NP組；EPE組初診孕周、終正孕周早于NP組和LPE組，LPE組早于NP組;EPE組及LPE組新生兒1分鐘Apgar評分低于NP組，EPE組5分鐘Apgar評分低于NP組;EPE組新生兒體質量低于NP組和LPE組，LPE組低于NP組；EPE組新生兒轉科率高于NP組和LPE組，LPE組高于NP組（均Plt;0.05 ）。見表1。本研究經我院倫理委員會批準（審查編號：2023-L110），所有人組對象均簽署知情同意書。1.2主要試劑KLF4抗體（Abcam公司），GAPDH抗體（Proteintech公司），SDS-PAGE凝膠快速試劑盒（賽維爾公司），WB一抗稀釋液（Beyotime公司），人KLF4酶聯免疫吸附試劑盒（mlbio公司）。

1.3免疫組織化學檢測胎盤組織固定、包埋、切片，漂烘儀烤片，脫蠟、復水、抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶。 5% 牛血清白蛋白溶液封閉 20min 。一抗 4^°C 孵育過夜，復溫后二抗室溫孵育 30min 。DAB顯色、蘇木素染核，脫水脫蠟、封片。顯微鏡下拍片，根據染色判定陽性等級。

1.4蛋白質印跡法檢測提取胎盤組織蛋白并測定濃度，按試劑盒說明制備分離膠和濃縮膠，電泳后轉移至PVDF膜上進行封閉，孵育后顯影成像，利用ImageJ、GraphPadPrism8.0.1軟件對圖像進行分析和作圖統計。

1.5酶聯免疫吸附試驗采用人KLF4試劑盒測定外周血及臍動脈血血清中KLF4濃度。樣品先稀釋5倍，按梯度濃度依次加樣，加酶、溫育、洗滌、顯色后測定吸光度（OD）。繪制標準曲線，計算樣品的實際濃度。

1.6統計學處理應用SPSS26.0統計學軟件進行數據分析，GraphPadPrism8.0.1軟件作圖。正態分布或近似正態分布的計量資料以 描述，多組間比較采用ANOVA檢驗，兩兩比較采用 q 檢驗;兩獨立樣本比較采用 χ_t 檢驗；非正態分布的計量資料以 M （P₂₅，P₇₅） 描述，組間比較采用Kruskal-Wallis H 檢驗；計數資料以頻數或率描述，組間比較采用 χ² 檢驗或Fisher確切概率法；相關性分析采用Pearson相關性檢驗。 Plt;0.05 為差異有統計學意義。

2結果

2.1胎盤組織中KLF4的表達免疫組織化學染色顯示，KLF4主要表達于合體滋養細胞層（syncy-tiotrophoblast，STB），PE組胎盤組織中呈低表達趨勢

（圖1、表2）。

蛋白印跡法顯示，PE組胎盤組織中KLF4蛋白相對表達量為 0.61±0.10 ，低于NP組的 0.98±0.11 ，差異有統計學意義 （t=5.65，Plt;0.05） ，見圖2；EPE組胎盤組織中KLF4蛋白相對表達量為 0.34±0.09 ，低于LPE組的 0.67±0.12 ，差異具有統計學意義（ t= 4.17，Plt;0.05 ），見圖3。

2.2PE患者外周血和臍動脈血清中KLF4濃度ELISA法檢測顯示，PE組母體外周血清中KLF4濃度為 1.78±0.09 ，低于NP組的 1.85±0.08 ，差異有統計學意義（ ;PE組臍動脈血血清中KLF4濃度為 1.56±0.13 ，低于NP組的 1.66± 0.08，差異有統計學意義 ）。

2.3PE患者血清KLF4水平與 24h 尿蛋白相關 性Pearson相關性分析顯示，PE患者血清KLF4水 平與 24h 尿蛋白呈負相關 （r=-0.7150，Plt;0.001， ，隨 著血清KLF4水平降低，患者 24h 尿蛋白量增加。見 圖4。

A：KLF4蛋白電泳條帶;B：KLF4蛋白相對表達量柱狀圖。

3討論

子癇前期發病機制錯綜復雜，通常認為與母體、胎兒、胎盤和臍帶等各種因素密切相關4。胎盤和臍帶不僅建立母胎循環，保證胎兒與母體之間進行物質交換，同時擔任免疫屏障的角色，保護胎兒免受母體免疫系統的攻擊，而滋養層功能的破壞可能導致胎兒生長受限和先兆子癇。諸多研究表明，胎盤形成不良和胎盤局部炎癥反應是導致諸多妊娠期并發癥的始作俑者6-7。KLF4在人體內多組織、多器官中廣泛表達，在細胞增殖與分化、遷移和凋亡、血管重塑以及胚胎發育中發揮不可或缺的作用[8-9]。BLANCHON等[證實KLF4、KLF6與胎盤生乳素（placentallactogen，PSG）共表達于胎盤絨毛和胎膜細胞，PSG水平降低與先兆子癇密切相關[11-12]。研究表明，在抗磷脂抗體激活內皮細胞過程中，KLF4受抑會增強 NF-κB 轉錄活性，促進凝血酶原與促炎基因表達；反之則可抑制 NF-κB 轉錄活性及相關炎癥與促凝因子表達[13]。推測KLF4在胎盤中異常表達可導致胎盤形成不良，同時介導母體免疫反應，進而使血管內皮功能受損，最終引發妊娠期高血壓疾病。

本研究發現，PE組胎盤組織中KLF4的表達明顯低于NP組，且在EPE組中表達更低，提示發病時間越早，KLF4表達越低?；颊?24h 尿蛋白定量是判斷子癇前期發病及進展的重要指標之一[14，本研究Pearson相關分析顯示，PE患者血清KLF4水平與24h 尿蛋白呈負相關，提示KLF4表達水平隨著母體PE病情的進展而降低。

綜上所述，子癇前期患者胎盤組織、外周血和臍動脈血中KLF4表達降低，其外周血清KLF4水平與24h 尿蛋白量呈負相關，提示KLF4低表達與子癇前期的發生發展有關。

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（本文編輯繆宏建）