亞胺培南有關物質測定方法的優化

摘要：目的 優化亞胺培南有關物質的測定方法。方法 采用C18色譜柱（Inertsil ODS-3，4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為pH7.3磷酸鹽緩沖液-乙腈（99.3：0.7），流動相B為pH7.3磷酸鹽緩沖液-乙腈（75：25）；線性梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣體積10 μL。結果 亞胺培南峰與各雜質峰分離度良好，亞胺培南在0.5～100.0 μg/mL范圍內線性良好，檢測限為0.2 μg/mL（0.02%），重復性符合規定。結論 本方法靈敏度高，分離效果好，可實現對亞胺培南已知雜質和聚合物雜質進行同時檢測。

關鍵詞：亞胺培南；有關物質；聚合物；方法優化；質量控制

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Optimization of the HPLC method for determination

of related substances in imipenem

Jia Yanhua， Peng Jie， Luo Jialin， Li Pei， Ding Zishan， and Hong Jianwen

（Guangdong Institute for Drug Control， Guangzhou 510663）

Abstract Objective To optimize the determination method of related substances in imipenem. Methods The HPLC analysis was performed on a C18 column（Inertsil ODS-3， 4.6 mm × 250 mm， 5 μm）; the mobile phase A was phosphate buffer-acetonitrile （99.3：0.7， V/V） with pH value of pH7.3， and the mobile phase B was phosphate buffer-acetonitrile （75：25， V/V） with pH value of pH7.3. The gradient elution was performed， and the flow rate was 1.0 mL/min. The column temperature was 30 ℃， and the detection wavelength was 210 nm. The injection volume was 10 μL. Results The peaks of imipenem and its related substances were separated well. The linearity was good within the range of 0.5～100.0 μg/mL，" and the limit of detection was 0.2 μg/mL （0.02%）. Repeatability met the requirements. Conclusion The method had the advantages of high sensitivity and good resolution， and could be used for the simultaneous detection of impurities and polymers.

Key words Imipenem; Related substances; Polymers; Method optimization; Quality control

亞胺培南（imipenem）是含碳青霉烯環的硫霉素類廣譜抗生素，具有高效、廣譜、耐酶和毒性小等特點[1]。但亞胺培南易被體內腎脫氫肽酶-I（DHP-I）代謝失活，需與DHP-I抑制劑西司他丁鈉以1：1的比例聯合用藥，故臨床常見的制劑為亞胺培南西司他丁鈉注射劑[2-3]。臨床主要適用于多種病原體所致和需氧或厭氧菌引起的混合感染，以及在未確定病原菌時的早期治療[4]。亞胺培南/西司他丁鈉注射劑耐受性良好，最常見的不良反應有紅斑、局部疼痛和硬結，血栓性靜脈炎等局部反應，皮疹、瘙癢和蕁麻疹等皮膚過敏反應，惡心、嘔吐和偽膜性腸炎等胃腸道反應，偶見白細胞減少癥等血液方面不良反應，也具腎及肝功能損害，但為罕見[5-6]。

國內亞胺培南原料現有批準文號3個。其質量標準在國外藥典均已收載，而《中國藥典》尚未收載。在對其有關物質控制方面，USP-NF中未設置有關物質檢測項，JP18僅對亞胺培南雜質A（硫霉素）作為已知雜質進行控制，BP 2024控制了亞胺培南雜質A（硫霉素）和雜質B1和B2。亞胺培南屬β-內酰胺類抗生素，該類抗生素易產生聚合物類雜質。研究證明，聚合物類高分子雜質是引發過敏反應的原因之一，它是引發速發型過敏反應的過敏原[7-8]。對有關物質和聚合物類雜質的控制，是保證抗生素類藥品安全性的重要環節，也一直是國內外藥品質量控制的研究熱點之一[9]。本文參考BP 2024及國內現行企業標準，優化亞胺培南有關物質色譜條件，實現了對亞胺培南已知雜質和聚合物類雜質的同時檢測。

1 儀器設備與試藥

1.1 儀器設備

高效液相色譜儀（島津LC-20AT、Agilent 1290 Infinity II/G7104A），液相色譜/質譜聯用儀（Waters XEVOG2 Qtof），電子分析天平（SARTORIUS Secura 225D-1CN型）。

1.2 試藥

亞胺培南對照品（EP公司，批號4.0，93.0%）；亞胺培南雜質A（硫霉素）、亞胺培南雜質B、亞胺培南二聚物1及亞胺培南二聚物2，來源均為珠海聯邦制藥股份有限公司。乙腈（Honeywell公司，色譜純），其他試劑均為分析純。

1.3 樣品

樣品共10批，分別來自國內3家企業及國外1家企業，基本涵蓋目前國內現狀。

2 方法

2.1 有關物質HPLC分析方法

2.1.1 色譜條件

采用Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；以緩沖液A（取無水磷酸氫二鈉1.04 g與無水磷酸二氫鈉0.32 g，加水900 mL使溶解，用稀磷酸調節值pH至7.3，用水稀釋至1000 mL）-乙腈（99.3：0.7）為流動相A，以緩沖液A-乙腈（75：25， V/V）為流動相B，按表1進行梯度洗脫；柱溫為30 ℃；檢測波長為210 nm；進樣體積為10 μL。

2.1.2 質譜分析條件

離子源：ESI源，正離子模式； 掃描模式：Full MS；掃描范圍：50～1200 m/z；離子源溫度：100℃；毛細管電壓2 kV。

2.2 溶液的配制

2.2.1 系統適用性溶液

亞胺培南峰鑒別溶液：取樣品約5 mg，置10 mL量瓶中，加稀硫酸-水（1：200，V/V）8 mL使溶解，放置5 min，加入碳酸鈉10 mg，用水稀釋至刻度。

聚合物峰鑒別溶液：取樣品約35 mg，置10 mL量瓶中，加0.05%三氟乙酸溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，在冷藏條件下放置約5～10 h內使用。

2.2.2 供試品溶液

溶劑：緩沖液B（取無水磷酸氫二鈉0.11 g，加水900 mL使溶解，用稀磷酸調節pH值至6.8，用水稀釋至1000 mL）-乙腈（99.3：0.7，V/V）。

供試品溶液：取樣品約25 mg，精密稱定，置25 mL量瓶中，加溶劑溶解稀釋至刻度。臨用新制。

2.2.3 對照溶液

精密量取供試品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度。

2.3 測定法

精密量取空白溶劑、亞胺培南峰鑒別溶液、聚合物峰鑒別溶液、供試品溶液及對照溶液各10 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。采用主成分自身對照法以峰面積計算樣品中已知雜質和未知雜質的含量。

2.4 方法驗證

照《中國藥典》2020年版四部通則9101分析方法驗證指導原則對本方法進行驗證。

2.4.1 專屬性

（1）系統適用性

取“2.2.1”項下系統適用性溶液，依法進行測定，對各雜質間的分離度進行考察。

（2）強制降解實驗

取某生產企業樣品，照“2.2.2”項下配制供試品溶液，置不同條件下進行降解實驗。

①酸破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，加0.1 mol/L鹽酸0.5 mL，室溫放置10 min，加0.1 mol/L氫氧化鈉溶液0.5 mL調節至中性。

②堿破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，加0.1 mol/L氫氧化鈉0.5 mL，室溫放置10 min，加

0.1 mol/L鹽酸溶液0.5 mL調節至中性。

③氧化破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，加10%過氧化氫溶液0.5 mL，室溫放置10 min。

④熱破壞溶液制備：取供試品溶液10 mL，60 ℃水浴加熱30 min。

⑤紫外破壞溶液制備：取供試品溶液置于紫外光燈（365 nm）下照射24 h。

⑥光照破壞溶液制備：取供試品溶液置于4500lx強光下照射72 h。

⑦高濕破壞溶液制備：取供試品粉末置于相對濕度90%的密閉容器中，放置24 h后配制成供試品溶液。

2.4.2 LOQ（定量限）與LOD（檢測限）

取亞胺培南對照品適量，加溶劑逐步稀釋制成定量限與檢測限溶液，以信噪比（S/N）=10時濃度為定量限，以信噪比（S/N）=3時濃度為檢測限。

2.4.3 線性與范圍

取亞胺培南對照品適量，加溶劑稀釋制成濃度分別為0.5、5.0、10.0、40.0、80.0和100.0 μg/mL的系列濃度溶液，分別進樣；以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸分析。

2.4.4 耐用性

通過改變柱溫、色譜柱類型及高效液相色譜儀品牌等條件，進行耐用性考察。

2.4.5 重復性

取某生產企業同一批次樣品，照“2.2.2”項下制備6份供試品溶液，依法測定各雜質含量，考察重復性。

2.4.6 溶液穩定性

取供試品溶液分別于8 ℃和25 ℃（即室溫）條件下放置0、1、2、3、5、6和7 h，測定各雜質含量，評價供試品溶液的穩定性。

3 結果與討論

3.1 色譜柱的選擇

選取不同品牌及規格的色譜柱進行實驗，發現Inertsil ODS-3（4.6 mm×250 mm，5 μm）比Agilent ZORBAX SB-C18（25 cm×4.6 mm，5 μm）、 OSAK SODA CAPCELL PAK C18 MG（25 cm×4.6 mm，5 μm）色譜柱分離度更佳，因此選擇其作為本方法的適用色譜柱。

3.2 檢測波長的選擇

取亞胺培南對照品溶液及系統適用性溶液，利用DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內掃描主成分和各雜質峰的吸收波長（圖1），綜合考慮主成分和各已知雜質紫外吸收情況，參考BP2024和各企業現行標準，選擇210 nm作為檢測波長，由于亞胺培南的雜質對照品不易獲取，采用加校正因子的自身對照法計算有關物質。

3.3 新HPLC方法與BP2024方法的比較

本方法對BP2024亞胺培南有關物質分析方法中推薦的C18短色譜柱（4.6 mm×150 mm，3 μm）改為C18長柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），同時對流動相梯度洗脫程序（梯度時間由29 min改為76 min）、系統適用性溶液（增加了聚合物峰鑒別溶液）、測定方法（由主成分外標法改為自身對照法）及已知雜質控制（增加了二聚物1和二聚物2的控制）進行了優化。優化后的色譜方法采用填料內徑為5 μm的C18長柱，能同時對亞胺培南二聚物1和二聚物2雜質進行控制，諸雜質的分離良好，且各雜質峰的峰形亦較理想。可滿足對不同企業產品質量控制的需要。

3.4 方法學驗證

3.4.1 系統適用性

對已知雜質的結構和來源進行分析，亞胺培南雜質B1（差向異構體1）、雜質B2（差向異構體2）、雜質A（硫霉素）及二聚物雜質均為降解雜質，可由主成分在酸或堿破壞條件下產生。在亞胺培南峰鑒別溶液的色譜圖中，亞胺培南主峰保留時間約為12 min，雜質B1（差向異構體1）、雜質B2（差向異構體2）和雜質A（硫霉素）峰的相對保留時間分別約為0.36、0.38和0.83，雜質B1（差向異構體1）的峰高與雜質B1（差向異構體1）和雜質B2（差向異構體2）兩峰之間的峰谷之比約為3.5；聚合物峰鑒別溶液色譜圖中二聚物1和二聚物2峰的相對保留時間分別約為2.81和3.81。各色譜峰之間可實現有效的分離（圖2）。

3.4.2 強制降解實驗

在強制降解實驗（酸、堿、氧化、熱、紫外、光照、高濕）中，各雜質峰與亞胺培南主成分峰的分離度均良好，亞胺培南可能的降解雜質均不干擾亞胺培南主峰的測定（圖3）。

3.4.3 LOQ與LOD

本方法的定量限濃度為0.5 μg/mL，相當于供試品溶液的0.05%；檢測限濃度為0.2 μg/mL；相當于供試品溶液的0.02%。靈敏度滿足要求。

3.4.4 線性范圍

線性方程為Y=21592.9X+4478.6（r=1.0000）。本方法在濃度0.5～100.0 μg/mL范圍內線性良好。

3.4.5 耐用性

改變柱溫、色譜柱及高效液相色譜儀類型對亞胺培南主峰和各雜質峰影響較小，各雜質峰仍能較好分離，各已知雜質相對保留時間變化不大（表2）。

3.4.6 重復性

取某生產企業同一批次樣品6份進行測定，雜質B1測定結果為0.1%（RSD為0），雜質B2測定結果為0.1%（RSD為0），雜質A測定結果為0.2%（RSD為0），二聚物1未檢出，二聚物2未檢出，其他單雜未檢出，雜質總和為0.4%（RSD為0），提示方法的重復性良好。

3.4.7 溶液穩定性

隨放置時間的增加，樣品中各雜質的含量均有增幅，增長趨勢為25 ℃較8 ℃明顯。8 ℃條件下，雜質B1和雜質B2增長明顯，2.5 h后雜質B1由最初的0.13%增長至0.25%，雜質B2由最初的0.09%增長至0.19%；雜質A變化不顯著，RSD為1.2%；二聚物均未檢出。25 ℃條件下，雜質B1和雜質B2在放置1.3 h

后即增長1倍，雜質A變化不顯著，二聚物均未檢出。提示進行有關物質檢測時，應臨用新制且控制進樣器溫度，以減少樣品降解對結果的影響。

3.5 雜質結構研究

采用液質聯用技術對亞胺培南中主要雜質的結構進行推測。BP 2024中已明確給出了雜質B1、雜質B2和雜質A的結構，本方法推測的結果與BP 2024基本一致。亞胺培南二聚物1和二聚物2的質譜圖見圖4，雜質結構推測見表3。

3.6 樣品測定

取4個生產企業的10批次樣品進行測定，各企業樣品中有關物質雜質含量存在一定差別，B、D兩企業樣品中亞胺培南雜質A（硫霉素）含量幾乎比A、B兩企業高出一倍，其中D企業樣品接近BP2024該雜質限度（1.0%）的要求，4個企業10批次樣品中均未檢出二聚物雜質（表4）。

4 結論

本文建立的亞胺培南有關物質的HPLC方法，可同時測定亞胺培南雜質B1、雜質B2、雜質A及二聚物雜質，具有專屬性強、靈敏度高等特點，能滿足對不同企業產品質量控制的需要。與BP2024方法相比，優化后的方法對雜質的檢出更為全面，且樣品中的二聚物含量體現出產品中聚合物的水平，具有重要的質控意義。本方法為《中國藥典》質量標準增修訂提供了參考。

參 考 文 獻

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收稿日期：2024-12-06

項目基金：廣東省藥品監督管理局科技創新項目（No. 2023TDB04）；廣東省醫學科學技術研究基金項目（No. B2023235）

作者簡介：賈艷花，女，生于1980年，碩士，主管藥師，研究方向為藥物質量分析與標準研究，E-mail： 39798582@qq.com

*通信作者，E-mail： 553875096@qq.com

第一作者：賈艷花，女，生于1980年，碩士，主管藥師，2010年起就職于廣東省藥品檢驗所，主要從事化學藥品的檢驗檢測及檢驗標準的起草研究，多次參與或承擔國家藥品抽檢工作、藥品標準起草或復核工作。

通信作者：洪建文，女，生于1972年，博士，主任藥師，廣東省藥品檢驗所二級調研員，第十一、十二屆國家藥典委員。主持完成多項國家、省、部級科研項目，藥典會專項和藥品標準的制修訂工作。參與項目獲中國藥學會科學技術二等獎。獲發明專利1項，發表論文40多篇，SCI收載2篇。