注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查法的優化

摘要：目的 對注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查法進行優化并建立符合新版《中國藥典》要求的統一檢測方法。方法 依據《中國藥典》2025年版四部通則1101無菌檢查法公示稿（第二次），通過對供試液濃度、每膜過濾樣品量、試驗菌株和陽性對照菌、沖洗液和沖洗次數、中和劑及其使用方式、使用量等因素的考察，對注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查中的供試液濃度、沖洗液和沖洗次數、中和劑及其使用量等方面進行優化。結果 采用與2020年版《中國藥典》相同的菌株為試驗菌，使用優化的無菌檢查法對21個廠家的樣品進行實驗確認，結果均符合規定。結論 該方法能有效去除注射用頭孢呋辛鈉的抑菌性，操作簡單，高效可靠，可作為適合《中國藥典》新變化的無菌檢查方法應用。

關鍵詞：注射用頭孢呋辛鈉；無菌檢查法；頭孢菌素酶；陽性對照；方法適用性試驗

中圖分類號：R917 文獻標志碼：A

Optimization of the sterility test method of cefuroxime sodium for injection

Ou Guodong， Jiang Yanfang， Xiao Jianguang， Liu Yuchun， and Lai Shan

（Guangdong Institute of Drug Control， Guangzhou 510663）

Abstract Objective To optimize the sterility test method of cefuroxime sodium for injection and establish a unified test method that met the new requirements for the Chinese Pharmacopoeia. Methods Based on the second draft of public notice for the sterility test method in general rule 1101 of Chinese Pharmacopoeia No. 4 （2025 Edition）， the factors such as the concentration of test solution， the volume of samples filtered per membrane， the test strains and positive control strains， the rinse solution and rinsing times， the neutralizer and its usage， the usage amount， etc， were investigated to optimize the sterility test method of cefuroxime sodium for injection in the aspects of the concentration of test solution， the rinse solution and its rinsing times， the neutralizer and its usage amount， etc. Results The optimized sterility test method was used to experimentally confirm the samples from twenty-one manufacturers， using the same strain as the 2020 edition as test strains， and all the results met the requirements. Conclusion This method， effectively eliminating bacteriostasis and suitable for the new changes in the Chinese Pharmacopoeia， can be used as a sterility test method of cefuroxime sodium for injection， which is easy to operate， efficient and reliable.

Key words Cefuroxime sodium for injection; Sterility test; Cephlosporinase; Positive control; Method applicability test

頭孢呋辛鈉由英國葛蘭素公司研發，是一種半合成第二代頭孢菌素類抗生素。注射用頭孢呋辛鈉由頭孢呋辛鈉原料無菌分裝制得。其對大部分革蘭陽性菌的抑菌作用與第一代頭孢相仿，可抑制化膿性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等致病菌；對革蘭陰性菌的作用較第一代頭孢強，臨床上用于對頭孢呋辛敏感的細菌引起的呼吸道感染、耳鼻喉科感染、泌尿道感染、皮膚和軟組織感染等[1-4]。據統計，國內現有注冊企業73家，包括70家國內生產企業和3家進口企業，9個制劑規格（0.25、0.5、0.75、1.0、1.5、2.0、2.25、2.5和3.0 g）。

注射用頭孢呋辛鈉是2024年國家藥品監督抽檢品種，共計抽檢302批次，覆蓋32個省/直轄市/自治區，涉及37家企業7個規格。對不同藥企的無菌檢查方法進行對比（表1），可見，雖都采用薄膜過濾法聯合使用中和劑進行檢驗，但在供試液、每膜過濾量、沖洗液和沖洗次數、中和劑及使用量和陽性對照菌等方面均存在差異。由《中國藥典》2025年版無菌檢查法公示稿可知，對抗生素品種的沖洗次數建議不少于3次不超過5次，對試驗菌株的選擇和陽性對照菌的要求方面也有變化。為了適合新版藥典的要求，提高該品種無菌檢查法的準確性、合規性和可靠性，本文針對建立藥品無菌檢查方法的4個關鍵步驟（圖1）開展研究，采用薄膜過濾法聯合使用頭孢菌素酶，優化了注射用頭孢呋辛鈉的無菌檢查方法。

1 儀器與材料

1.1 設備和耗材

MAST-A-350SD-A-S高壓滅菌器（山東新華醫療器械公司）；BSC-1600ⅡA2生物安全柜（蘇州安泰空氣技術公司）；IN812C生化培養箱（重慶雅馬拓科技公司）；BMS-6002集菌儀（杭州標邁生物技術公司）；FC752A薄膜過濾器、KDGB220D和KDGB330D集菌培養器（浙江泰林生命科學公司）；NS01-75D12無菌導液管（北京牛牛基因技術公司）；3.5 L厭氧產氣袋（批號3354LH-4，日本三菱瓦斯化學株式會社）

1.2 培養基和試劑

計數和增菌用培養基詳見文獻[6]，其中TSA（批號231019A20）、TSB（批號240329A20）、SDB（批號230413A20）、FTM（批號1111681）和哥倫比亞瓊脂培養基（批號240103A30）均購自廣東環凱微生物科技有限公司；SDA（批號231223）購自北京陸橋技術股份有限公司。培養基的適用性檢查和靈敏度檢查均符合《中國藥典》的規定。

聚山梨酯80（批號20210401）、氯化鈉（批號20240401 10）購自廣州化學試劑廠；pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（批號240306）購自北京三藥科技開發公司；青霉素酶（批號6012388D，規格≥1000萬單位/支，酶活性為1826.11萬單位/支）、頭孢菌素酶（批號70423104D，規格≥1000萬單位/支，酶活性為434.78萬單位/支）購自杭州北望生物技術有限公司。

稀釋液為0.9%無菌氯化鈉溶液，沖洗液1為pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，沖洗液2為含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。

1.3 試藥

注射用頭孢呋辛鈉，規格0.75、1.5和2.0 g（按C16H16N4O8S計），來自國產企業19家和進口企業2家，分別以代號1～21表示。21家注射劑的原料藥來源于9家企業，分別以代號A～I表示。注射劑采用A原料的藥企有5、13、18、20和21；采用B原料的藥企有1、3、9和14；采用原料C的藥企有8和12；采用D原料的藥企有2、4和7；采用E原料的藥企有6、10和11；采用F～I原料的藥企分別為19、17、16和15。

1.4 菌種

試驗用菌株不超過5代，詳見文獻[7]，主要有金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、銅綠假單胞菌CMCC（B） 10104、生孢梭菌CMCC（B）64941、枯草芽胞桿菌CMCC（B）63501、白念珠菌CMCC（F）98001和黑曲霉CMCC（F） 98003，均購自中國食品藥品檢定研究院。

2 方法

2.1 菌液制備

取“1.4”項下的各菌株按文獻[8]方法進行培養和稀釋，其中銅綠假單胞菌同金黃色葡萄球菌，本文所有試驗用菌株均配制成每毫升不超過100 CFU的菌懸液或孢子懸液。

2.2 實驗樣品選擇

結合本次抽樣情況，選擇21家藥企3個規格（0.75、1.5和2.0 g）的注射劑進行實驗，樣本涵蓋了全部9家企業的原料藥，樣品量約為總抽樣量的78%。

2.3 供試液制備

取本品適量，分別用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液或50 mg/mL的供試液。

2.4 預試驗

2.4.1 陽性對照菌確認

分別吸取0.1 mL由樣品10制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液或含頭孢呋辛鈉為50 mg/mL的供試液置于不同的無菌平皿中，再分別加入菌液1 mL，細菌（不包括生孢梭菌）平皿傾注適量TSA，真菌平皿傾注適量SDA；均平行制作兩個平皿作為試驗組，置于規定溫度培養計數；同法操作，分別制作菌液組和稀釋液組為空白對照。

分別吸取1 mL由樣品10制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液或含頭孢呋辛鈉為50 mg/mL的供試液，加入100 mL沖洗液1中，濾過，每筒分別用300 mL沖洗液1沖洗濾膜3次，最后一次分別加入菌液1 mL，取出濾膜貼于TSA平板上作為試驗組，置于規定溫度培養計數；同法操作，分別制作菌液組和稀釋液組為空白對照。

2.4.2 供試液濃度、沖洗液和沖洗次數考察

取KDGB220D集菌培養器10套，每筒過濾150 mL由樣品8制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液或75 mL含頭孢呋辛鈉為50 mg/mL的供試液，每筒分別用300～600 mL沖洗液1或沖洗液2沖洗濾膜3～6次，最后1次分別加入金黃色葡萄球菌或枯草芽胞桿菌菌懸液1 mL，加入100 mLFTM或TSB后置于規定溫度培養。實驗中同時設立陽性對照組和陰性對照組。

2.4.3 每膜過濾量挑戰考察

取KDGB330D集菌培養器1套，其中一筒過濾300 mL由樣品8制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，每筒用500 mL沖洗液2沖洗濾膜5次，最后1次加入枯草芽胞桿菌菌懸液1 mL，加入100 mL TSB后置于規定溫度培養。實驗中同時設立陽性對照組和陰性對照組。

另取KDGB220D集菌培養器11套，每筒分別過濾300 mL由樣品1～7、9～21制成含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，其他操作同上。

2.4.4 中和劑考察

（1）中和劑使用方式選擇" 取KDGB220D集菌培養器5套，每筒分別過濾300 mL由樣品8制成含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，每筒用沖洗液2沖洗濾膜3次，最后1次加入枯草芽胞桿菌菌懸液1 mL，分別加入100 mL含30萬單位或60萬單位的頭孢菌素酶的TSB；或每筒用300 mL含30萬頭孢菌素酶的沖洗液2或300 mL 60萬頭孢菌素酶的沖洗液2沖洗濾膜3次，最后1次加入枯草芽胞桿菌菌懸液1 mL，分別加入TSB；均置于規定溫度培養。實驗中同時設立陽性對照組和陰性對照組。

（2）中和劑及其使用量考察" 取KDGB220D集菌培養器5套，每筒分別過濾300mL由樣品8制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，每筒用300 mL沖洗液2沖洗濾膜3次，最后1次加入枯草芽胞桿菌菌懸液1 mL，分別加入100 mL含30萬單位或60萬單位的頭孢菌素酶的TSB和分別加入100 mL含300萬單位或600萬單位的青霉素酶的TSB，均置于規定溫度培養。實驗中同時設立陽性對照組和陰性對照組。

另取KDGB220D集菌培養器42套，每筒分別過濾300 mL由樣品1～7、9～21制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，其他操作同上。

2.5 無菌檢查方法適用性試驗

取KDGB330D集菌培養器43套，每筒分別過濾300 mL由樣品1～21制成的含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，每筒用300 mL沖洗液2沖洗濾膜3次，最后1次分別加入菌液1 mL，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、生孢梭菌中分別加入100 mL含30萬單位頭孢菌素酶的FTM；枯草芽胞桿菌、白念珠菌和黑曲霉中分別加入100 mL含30萬單位頭孢菌素酶的TSB；均置于規定溫度培養。實驗中同時設立陽性對照組和陰性對照組。

3 結果與討論

3.1 結果

3.1.1 試驗關鍵影響因素探討

《中國藥典》2020年版收載的注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查方法為薄膜過濾聯合使用青霉素酶法。本文以控制沖洗次數且能有效去除其抑菌性為目標，對該無菌檢查方法進行優化。

（1）沖洗流速及濾膜選擇" " 沖洗流速的過快或過慢對實驗結果均有一定的影響[9]，有研究表明把沖洗泵轉速從220 r/min降低到160 r/min時，可以較好地消除供試品的抑菌作用[10]，故本文在實驗中確定沖洗泵轉速為160 r/min。為防止過濾時抗生素類注射劑在濾膜上的吸附，須采用低吸附性的濾膜。尼龍膜耐受性好，對抑菌成分吸附性低[11]，故本研究統一使用尼龍66膜的集菌培養器。

（2）試驗菌和陽性對照菌的確認" " 注射用頭孢呋辛鈉對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有抑制作用。預試驗中，在含25或50 mg/mL頭孢呋辛鈉平皿法上，除銅綠假單胞菌、白念珠菌和黑曲霉的回收率分別為0.8/0.1、1.0/0.7和0.8/0.7外，其他試驗菌的回收率均為0。可見，頭孢呋辛鈉對細菌有很強的抑制作用，對真菌的作用較弱，且對大腸埃希菌的抑制作用比銅綠假單胞菌更強，故選擇大腸埃希菌作為無菌檢查法適用性試驗的試驗菌株。利用含頭孢呋辛鈉為25或50 mg/mL的供試液進行薄膜過濾法預試驗，金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽胞桿菌的回收率分別為0.9/0.8、1.0/0.8和0.7/0.4。提示，頭孢呋辛鈉對枯草芽胞桿菌最為敏感，故確定采用枯草芽胞桿菌CMCC（B）63501為陽性對照菌和方法優化的試驗菌株。

（3）供試液濃度、沖洗液和沖洗次數選擇" "由預試驗結果可知，沖洗3～6次時，金黃色葡萄球菌均能在規定時間內達到生長良好的要求，不同供試液濃度和沖洗液對結果無明顯影響。沖洗3～4次時，枯草芽胞桿菌生長的重現性不好，但供試液濃度為25 mg/mL

時比50 mg/mL時稍好，結合回收率結果，選擇含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL作為供試液濃度。沖洗5～6次時，枯草芽胞桿菌均能在規定時間內達到生長良好的要求，且采用含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液的沖洗結果稍好。聚山梨酯80類非離子表面活性劑不具有抑菌性，且對微生物有保護作用，作為沖洗劑既可增加樣品的溶解性，又可增加沖洗液的洗脫力度，可有效消除供試品抑菌性[12]。故選擇含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液作為沖洗液，按新版藥典要求沖洗次數為5次。

（4）每膜過濾量挑戰考察" " 為了提高檢出的概率，考察每膜過濾量增加1倍，即每膜過濾頭孢呋辛鈉7.5 g對實驗結果的影響。由預試驗結果可知，采用枯草芽胞桿菌為陽性對照時，19家藥企產的產品在規定時間內陽性對照菌均能良好生長，1家藥企的產品陽性對照菌生長遲緩，1家藥企的產品陽性對照菌5 d內不能生長。提示實際應用中，樣品原料來源或生產工藝的差異，沖洗5次并不能去除所有供試品的抑菌活性。因而考慮采用薄膜過濾法聯合使用β-內酰胺酶作為中和劑消除可能殘留的抑菌作用。

（5）中和劑考察" " 在建立抗生素無菌檢查方法時中和劑被廣泛應用[13]。頭孢菌素酶可水解頭孢呋辛等頭孢菌素，在沖洗液或培養基中使用均可。由預試驗結果可知，在沖洗液或培養基中使用頭孢菌素酶效果相差不大，枯草芽胞桿菌在規定時間內均能達到生長良好的要求，考慮到檢驗效率和操作習慣，本文采用在培養基中添加中和劑。由表1可知，目前約54%的藥企使用青霉素酶作為中和劑。以枯草芽胞桿菌為陽性菌，選擇21家藥企的產品進行頭孢菌素酶和青霉素酶使用量的比較。在供試液濃度為含頭孢呋辛鈉25 mg/mL，每膜過濾頭孢呋辛鈉7.5 g，用300 mL沖洗液2沖洗濾膜3次時，培養基中中和劑為30萬單位頭孢菌素酶或300萬單位青霉素酶，枯草芽胞桿菌均能在規定時間內生長良好。表明在上述兩種條件下均可有效去除該品種的抑菌作用。考慮到頭孢呋辛為第二代頭孢菌素類抗生素，且在該條件下頭孢菌素酶使用量較青霉素酶小，故推薦采用頭孢菌素酶作為中和劑。

3.1.2 無菌檢查方法適用性試驗

采用21家藥企的注射用頭孢呋辛鈉進行無菌檢查，由方法適用性試驗結果可見，試驗組和對照組菌株均能在規定時間內達到生長良好的要求，表明該條件可有效去除頭孢呋辛鈉的抑菌性，可作為注射用頭孢呋辛鈉的無菌檢查方法。

3.1.3 優化的無菌檢查方法

注射用頭孢呋辛鈉優化后的無菌檢查方法為：取本品，用0.9%無菌氯化鈉溶液制成含頭孢呋辛鈉為25 mg/mL的供試液，按薄膜過濾法檢驗，每膜過濾頭孢呋辛鈉7.5 g，每膜用300 mL沖洗液2沖洗濾膜3次，沖洗后在其中一管泵入100 mL含30萬單位頭孢菌素酶的FTM，另兩管分別泵入100 mL含30萬單位頭孢菌素酶的TSB，其中一管加入含菌數不大于100 CFU/mL的枯草芽胞桿菌菌懸液作為陽性對照，分別置于規定溫度下培養，依法檢查。

3.2 討論

2024年國家藥品監督抽檢中的注射用頭孢呋辛鈉共計302批，按無菌檢查法進行檢驗，結果均符合規定。

《中國藥典》2025年版四部通則1101無菌檢查法公示稿（第二次）主要有3大改變。一是對試驗菌種的要求：“一般檢品采用銅綠假單胞菌，但對大腸埃希菌敏感的抗生素類產品宜選用大腸埃希菌代替銅綠假單胞菌”。二是對陽性對照：“取消了每次試驗需同時進行陽性對照試驗的要求，提倡實驗室基于質量風險管理的要求確定陽性對照試驗的必要性和頻次。”三是對沖洗次數的要求：“每張濾膜沖洗一般也不得超過5次”。

本文結果表明：①頭孢呋辛鈉對大腸埃希菌敏感，適用性試驗菌種應選擇為大腸埃希菌。但本品對枯草芽胞桿菌更為敏感，采用枯草芽胞桿菌進行方法的優化與確認更為合適。②本文通過對沖洗液流速、濾膜、供試液濃度、每膜過濾量和沖洗液的選擇優化，推薦采用薄膜過濾聯合使用中和劑頭孢菌素酶的方法進行無菌檢查，可有效去除頭孢呋辛的抑菌活性。

本文圍繞《中國藥典》的新變化，建立了注射用頭孢呋辛鈉的無菌檢查法：用含0.1%聚山梨酯80的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液按100 mL/膜/次沖洗，沖洗3次，100 mL培養基中含30萬單位頭孢菌素酶，采用枯草芽胞桿菌作為陽性對照菌。采用21家藥企樣品對新方法進行適用性確認，結果均符合規定。故可作為適合藥典新變化的注射用頭孢呋辛鈉無菌檢查方法應用。

參 考 文 獻

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收稿日期：2024-12-06

基金項目：2024年國家藥品抽檢中央補助地方經費項目資助國藥監藥管（No. [2024]1號）

作者簡介：歐國棟，男，生于1986年，主管藥師，主要從事藥品、化妝品微生物檢測工作，E-mail： 1305350823@qq.com

*通信作者，E-mail： 1093509842@qq.com

第一作者：歐國棟，男，生于1986年，畢業于華南農業大學制藥工程專業，學士，主管藥師，主要從事藥品、化妝品微生物檢測，參與廣東省醫學科研基金項目和藥典會標準制修訂工作，參與出版圖書3冊，發表論文5篇。

通信作者：賴珊，女，生于1977年，畢業于武漢大學藥劑學專業，碩士，副主任藥師，現任廣東省藥品檢驗所微生物室主任，主要從事藥品、化妝品微生物檢測與質量控制工作。作為本單位主要負責人參與藥典會標準制修訂工作多項，主持完成廣州市科技基金項目1項，獲廣東省化妝品協會科學技術進步獎特等獎，作為副主編參與出版圖書2冊，發表論文12篇。