莫匹羅星軟膏微生物限度檢查方法的優化與思考

摘要：目的 建立對莫匹羅星軟膏適用的微生物限度檢查方法，考察國內市售莫匹羅星軟膏微生物質控情況。方法 根據產品特性及其企業和藥典標準，對比分析7個微生物限度檢查方法，建立對目前市售莫匹羅星軟膏通用的微生物限度方法。結果 在方法適用性試驗中發現不同企業方法對黑曲霉的回收率有明顯差異，且部分企業方法存在一定局限性；采用新建立的方法對9個企業產品進行方法適用性試驗，結果均符合《中國藥典》2020年版相關規定。結論 新建立的方法可有效考察市售莫匹羅星軟膏微生物污染情況，既提高了檢驗效率，也保障了方法準確轉移，并為相關監管部門和生產企業提供一定參考。

關鍵詞：莫匹羅星軟膏；方法適用性試驗；薄膜過濾法；黑曲霉

中圖分類號：R 917 文獻標志碼：A

Optimization and consideration of microbial limit test method for

mupirocin ointment

Liu Peng1， Tan Huimin2， Cai Chunyan1， Wang Hao1， Ma Shihong1， and Yang Meiqin1

（1 National Institutes for Food and Drug Control，Beijing 100050; 2 GuangXi Institute For Drug Control， Nanning 530022）

Abstract Objective To establish a set of microbiological limit methods for mupirocin ointment and examine the microbial control of commercially available mupirocin ointment in China. Methods Comparison and analysis of the microbiological methods from 7 microbial limit testing methods， based on the nature of the products and the existing enterprise and pharmacopoeia standards， a microbiological test method applicable to the existing mupirocin ointment on the market was summarized. Results The test found that some of the enterprise methods still had certain limitations， and the recovery of Aspergillus niger by different methods had obvious differences; the newly established method was validated for applicability to the samples of 9 manufacturers， and the results were by the relevant provisions of the Chinese Pharmacopoeia. Conclusion The established method could effectively examine the microbial contamination of commercially available mupirocin ointment， which improved work efficiency and guarantees the accurate transfer of the method. It provided certain references for the relevant regulatory authorities and production enterprises.

Key words Mupirocin ointment; Method applicability test; Membrane-filter; Aspergillus niger

莫匹羅星軟膏為皮膚局部給藥制劑，多以聚乙二醇400、4000及3350為輔料，是用于革蘭陽性球菌引起的淺表性創傷合并感染等繼發性皮膚感染的廣譜抗生素，臨床應用廣泛，也促使更多新劑型的研發[1-6]。根據其處方工藝及給藥途徑，按《中國藥典》2020年版規定，產品中需氧菌總數（total aerobic microbial count， TAMC）不得過102 CFU/g，霉菌和酵母菌總數（total yeasts and molds count， TYMC）不得過101 CFU/g，1 g供試品中不得檢出金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌[7]。基于其抑菌活性和給藥方式，為避免產品中的微生物污染，應嚴格貫徹《良好藥品生產質量管理規范》（GMP），并建立合理有效的微生物質控方法，實現從源頭控制風險[8-9]。

莫匹羅星軟膏新藥保護期于1996年3月5日到期，新藥試行質量標準也于2009年轉正，屬于已有國家標準的外用制劑，國產制劑處方與原研產品一致。《中國藥典》2020年版未收載莫匹羅星軟膏，目前有9個企業生產該品種。2023年全國藥品抽檢共抽到172批莫匹羅星軟膏劑，覆蓋了全部國內9個企業的產品，部分注冊標準中的微生物限度方法存在方法不可行情況。為有效評價各企業產品的微生物污染情況，本文在分析各注冊標準微生物限度檢查法存在問題的基礎上，建立了一套通用的檢查方法，并可保障方法的準確轉移。采用該方法對全部抽樣樣品進行微生物限度檢查，結果均符合規定。

1 儀器及材料

電子天平（Sartorius-CPA2202S-DS），高壓滅菌器（Yamato-SQ510C），生物安全柜（NU-543-400S），恒溫培養箱（Yamato-INC821C），渦旋振蕩儀（IKA-MS3basic），一次性無菌濾杯（Merck，直徑47 mm，混合纖維素膜）。

培養基及試劑：胰酪大豆胨液體培養基（TSB）、亞碲酸鉀營養肉湯培養基（STB）、膽鹽乳糖培養基（BL）、營養瓊脂培養基（NA）、胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）、玫瑰紅鈉瓊脂培養基（RBA）、沙氏葡萄糖瓊脂培養基（SDA）、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（PB）和0.1%無菌蛋白胨水溶液（PW），均采用北京三藥科技有限公司產品，各培養基按《中國藥典》2020年版規定通過培養基適用性檢查[5]。聚山梨酯80（T80，國藥集團化學試劑有限公司）。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63501]，簡稱枯草；金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，簡稱金葡；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，簡稱銅綠；大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]，簡稱大腸；白念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98001]，簡稱白念；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98003]，均來自中國食品藥品檢定研究院。

9個生產企業172批莫匹羅星軟膏為2023年全國評價性抽驗樣品，規格2%。

2 方法

對9個生產企業涉及的7個質量標準中的微生物限度檢查方法的差異進行匯總分析（表1）。可見，7個標準中的檢查法雖然均參照《中國藥典》制訂，但其中僅1個標準依據《中國藥典》2020年版，另4個標準依據《中國藥典》2015年版，2個標準依據《中國藥典》2010年版。由于質量標準制訂年份的差異，各標準收載的方法存在較大差異。《中國藥典》2020年版與《中國藥典》2015年版相比較，微生物限度檢查方法差異不大，但與《中國藥典》2010年版相比，在檢驗用培養基體系和計數限值方面差異明顯（表2）[7，10-11]，因此，現階段《中國藥典》2010年版已失去被繼續參照執行的意義。而參照《中國藥典》2015年版制訂的4個標準，與《中國藥典》2020年版相比在微生物計數限值方面亦存在差異，且具體方法的可行性也待確認。基于上述差異，對表1匯總的莫匹羅星軟膏微生物限度檢查檢查方法的可操作性和合理性進行探討。

根據表1～2的分析結果，針對各企業的微生物限度檢查方法，討論4種供試液制備方法、3種微生物計數檢查方法以及4種控制菌檢查方法的可行性。

2.1 供試液制備方法

分別用含0、3%和4%聚山梨酯80（T80）的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（PB）與含20%聚山梨酯80的水溶液為稀釋液（表3），制備1：10供試液。

2.2 需氧菌總數（細菌數）檢查方法

采用薄膜過濾法進行需氧菌總數（細菌數）檢查。取1：10供試液1 mL，設置3種沖洗條件（表4）；供試液經濾過沖洗后，在最后一次沖洗液中加入試驗菌株，取薄膜貼至TSA/NA培養基上培養，檢測回收率。

2.3 霉菌和酵母菌（總）數檢查方法

《中國藥典》2020年版規定皮膚給藥制劑的TYMC的限值為不得過10 CFU/g[7]。表1中，兩個質量標準的TYMC限值為不得過10 CFU/g。

表1可見，大多采用平皿法，取1：10供試液（含不少于100 CFU/mL試驗菌株）1 mL/皿，傾注在RBA/SDA培養基上，檢測回收率。然而，樣品檢驗過程中若采用1：10供試液1 mL進行檢查，當試驗結果為lt;1、1或2 CFU/皿，臨近TYMC的標準限值時，根據誤差理論，結果判斷誤差超過70%[12]。為避免誤判風險，且使得操作更貼近實際檢驗，本文取1：10供試液5 mL，采用薄膜過濾法測定，并設置了2種沖洗條件（表5），在最后一次沖洗液中加入試驗菌株；沖洗后取薄膜貼至RBA/SDA培養基上，檢測回收率。

2.4 控制菌（金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌）檢查方法

直接接種法檢查時，取1：10供試液10 mL接種至100 mL藥典規定的培養基中。薄膜過濾法時，取1：10供試液10 mL，設置3個沖洗條件（表6），在最后一次沖洗液中加入試驗菌株，沖洗后取薄膜至100 mL TSB培養基上，記錄試驗菌株生長情況。

3 結果

按上述各方法試驗，獲得各方法組合的試驗結果。為了更直觀地表述差異，未將試驗菌株的具體回收率逐一列出。以計數試驗組回收率大于70%，控制菌陽性菌株生長良好，判斷該方法適用性試驗是否符合要求（表7）。以此為基礎討論莫匹羅星軟膏計數法和控制菌檢查法的合理性，并得到莫匹羅星軟膏通用性微生物限度檢查方法。

3.1 需氧菌總數（或細菌數）檢查方法

由表7可見，薄膜過濾法可較好的去除莫匹羅星的抑菌性。通過對“稀釋液-沖洗液-培養基體系”3個維度的討論，發現在基于《中國藥典》不同版本制訂的檢查法中，所有試驗菌株的回收率均大于70%，即均可以滿足計數方法對回收率的要求。提示在稀釋液中使用中和劑（聚山梨酯80），以及采用較大體積的沖洗液沖洗薄膜的必要性不大。本品為親水性軟膏，制劑中的聚乙二醇本身就是較好的增溶劑，因此采用PB直接作為稀釋液可以實現均勻分散供試液的目的。在采用1：10供試液取樣1mL進行試驗時，采用500 mL的PB的沖洗就可以實現試驗菌株的回收。

3.2 霉菌和酵母菌（總）數檢查方法

由表7可見，采用薄膜過濾法時，黑曲霉和白念珠菌2株試驗菌株的回收率均能滿足要求。即采用薄膜過濾法，取1：10供試液5 mL，以500 mL體積的PB沖洗，可以滿足對TYMC的檢查要求，試驗菌株可達到較高的回收率結果。

采用平皿法時，白念珠菌的回收率超過70%，但黑曲霉的回收率出現較大的差異。黑曲霉在RBA上培養5 d后，不同企業產品的回收率在51%～81%之間（表8），由于莫匹羅星軟膏具有抗菌活性[13]，菌落均生長緩慢且較小，說明方法本身存在一定的局限性。黑曲霉在SDA上培養5 d后，9個企業產品的回收率均為0，該方法（平皿法，1：10供試液，1 mL/皿）不適用于對莫匹羅星軟膏的TYMC檢查。

3.3 控制菌檢查方法

由表7可見，采用直接接種法時，無論在哪種培養基體系中，試驗菌株金黃色葡萄球菌均未見生長。采用薄膜過濾法，取1：10供試液10 mL，以500 mL

的PB沖洗，金黃色葡萄球菌生長良好。該特點也與本品在臨床上對金黃色葡萄球菌較好的抑菌作用的特性相符[14-15]。

在對銅綠假單胞菌的檢查過程中，由于該菌株本身具有較好的抗逆特性，采用直接接種法，在各版藥典的培養基體系下該試驗菌株均能生長良好。

綜上，結合《中國藥典》2020年版要求，建議采用薄膜過濾法進行本品的控制菌檢查，取1：10供試液10 mL，全量通過薄膜后，用PB沖洗5次（100 mL/次），

將薄膜接種至100 mL TSB中，依法檢查。

3.4 微生物限度檢查通用方法

根據上述討論，按照科學合理和簡化高效的原則，建議該品種通用的微生物限度檢查方法：取供試品10 g，加PB至100 mL，使分散均勻，作為1：10供試液。采用薄膜過濾法，取1：10供試液1 mL，全量通過薄膜后，用PB沖洗5次（100 mL/次），依法檢查需氧菌總數；取1：10供試液5 mL，全量通過薄膜后，用PB沖洗5次（100 mL/次），依法檢查霉菌和酵母菌總數；取1：10供試液10 mL，全量通過薄膜后，用PB沖洗5次（100 mL/次），將薄膜接種至100 mLTSB中，依法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

按照上述方法進行所有抽樣企業品種的方法適用性試驗，結果不僅均符合《中國藥典》2020年版要求，也可滿足即將頒布的《中國藥典》2025年版的規定。采用該新方法對2023年全國評價性抽驗9個企業的172批樣品進行檢驗，結果均符合規定。

4 討論

通過表1對各標準收載的方法的比對可見，對具有抗菌活性的產品通常采用中和劑或薄膜過濾的方式進行檢驗，擇其一或兼用是一種更為自主的選擇方式，但應用中應結合實際操作進行優化。而本文建議的通用性檢測方法更具有粗放性，便于實際應用。在實際優化過程中，其關鍵關注點可概括為：①由于本品具有抗菌活性，采用薄膜過濾法較直接接種法（或平皿法）表現出更好的方法耐用性。薄膜過濾是一種更為直接的去除抗菌活性物質的手段。②含有聚山梨酯80的稀釋液并未有更優的表現，聚山梨酯80作為非離子型表面活性劑是常用的中和抗菌活性組分的中和劑，但由于本品為親水性軟膏，在水中溶解性良好，在稀釋液或沖洗液中加入聚山梨酯80進行薄膜過濾時，不僅起不到增溶劑的作用，還會出現過量的泡沫，影響沖洗效果。如表3中，稀釋液D由于聚山梨酯80的濃度較高，如何保證稀釋液中聚山梨酯80的均勻分散，保證其發揮效果，對標準化操作提出了更高的要求[16-17]。③過大體積的沖洗量（超過500 mL）對微生物檢出沒有更多的貢獻，也不利于薄膜保持完整性。

我國藥品抽檢工作采用“分散抽樣、集中檢驗”的模式，抽檢樣品具有足夠的地域和生產企業代表性，承檢機構通過對抽檢產品的檢驗，可評估該品種在我國生產和流通領域的質量情況。一般同一品種的樣品涉及多個生產企業，樣品少則幾十批，多則上百批，企業執行的質量標準方法可能各不相同，若按各企業方法進行檢驗，在實驗中既需要分別制備大量的培養基和試劑，又要使用不同的試驗方法，造成實驗室人力、物力和時間的浪費，降低工作效率。建立統一簡化、科學合理的檢驗方法，不僅保證了檢驗結果的準確，也是提高工作效率的有效途徑。

抽檢工作中，承檢機構除了要考察藥品質量，還應對生產企業的質量標準體系進行評估，如項目是否完善、檢驗方法和限度設置是否科學合理等。若企業質量標準存在不合理或缺陷之處，應提出問題并給予建議。隨著我國藥典向國際標準的協調與接軌，微生物檢驗方法對限度標準、培養基制備等方面也進行了相應的修訂，生產企業應與時俱進，依據最新版藥典方法的變化對產品的檢驗方法及時進行修改，保證檢驗結果符合要求。生產企業應制定科學、準確的質量標準體系，從而在源頭確保藥品質量。

本文在對本品微生物限度標準比對中發現的問題，反映出產品在上市申請、生產過程監管過程中微生物控制體系存在的不足。類似情況，也并非個例[18]。由于非無菌產品使用風險低，可能其嚴重程度并不凸顯，但作為保障藥品質量安全的基本參數，不應成為質量標準的盲區。隨著國內微生物檢驗檢測體系基本與ICH要求的協調對接，近年來CDE也陸續出臺了系列指導原則幫助企業逐步規范和解決這些問題。具體可參考《已上市化學藥品藥學變更研究技術指導原則（試行）》等相應文件，逐步修訂具體品種的質量標準體系；此外，新品種在注冊申報過程中，可參考《非無菌化學藥品及原輔料微生物限度研究技術指導原則（試行）》等技術文件，從源頭上完善技術文件檔案，為后續修訂提供基礎。

參 考 文 獻

王小亮， 梁亞偉， 衷紅梅， 等. 莫匹羅星軟膏的質量評價[J]. 中國抗生素雜志， 2020， 45（3）： 252-258.

郭峰， 高永軍. 鹽酸米諾環素與莫匹羅星軟膏聯合治療聚合性痤瘡的療效觀察[J]. 中國醫院用藥評價與分析， 2016， 16（11）： 1487-1488.

楊洋， 李惠嫻， 黃遠梅， 等. 莫匹羅星軟膏與銀離子抗菌功能性敷料對淺Ⅱ度燒傷患者創面愈合、細菌清除率及感染指標的影響[J]. 臨床誤診誤治， 2023， 36（3）： 113-117.

馮中靜. 局部應用莫匹羅星軟膏治療新生兒臍炎療效觀察[J]. 臨床合理用藥， 2015， 8（1）： 101.

夏雪云， 劉清霞. 莫匹羅星軟膏聯合清得佳凝膠治療晚期癌癥患者壓瘡[J]. 實用中西醫結合臨床， 2015， 15（1）： 90.

李子烜， 黃吉， 孫震曉. 莫匹羅星劑型改造研究進展[J]. 國外醫藥（抗生素分冊）， 2023， 44（1）： 13-18.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2020年版四部）. 北京： 化學工業出版社， 2020： 附錄1105/1106.

楊育林， 吉瑩潔. 莫匹羅星軟膏微生物限度檢查的方法學驗證[J]. 藥學研究， 2014， 33（10）： 592-593.

李翠， 閔紅， 謝毓華， 等. 莫匹羅星軟膏微生物限度檢查方法適用性研究及水分活度測定[J]. 中國藥業， 2022， 31（5）： 76-79.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2010年版四部）. 北京： 化學工業出版社， 2010： 附錄XIJ.

國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典[S]. （2015年版四部）. 北京： 化學工業出版社， 2015： 附錄1105.

The United States Pharmacopieial Convention， The United States Pharmacopieial： General Chapters[S]. 42th edition.Rockville： The United States Pharmacopieial Convention， 2019， 8052-8056.

Nicholas R O， Berry V， Hunter P A， et al. The antifungal activity of mupirocin.[J]. J Antimicrob Chemother， 1999， 43（4）： 579-582.

Roghmann M， Lydecker D A， Langenberg P， et al. Microbiological effect of mupirocin and chlorhexidine for Staphylococcus aureus decolonization in community and nursing home based adults[J]. Diagn Microbiol Infect Dis， 2017， 88（1）： 53-57.

Barr J G， Hogg G M. Value of charcoal media for recovering staphylococci incorporated in mupirocin ointment[J]. J Clin Pathol， 1987， 40（4）： 372-376.

趙新霞， 楊淑先， 王海波， 等. 聚山梨酯80對藥品微生物限度檢查的影響[J]. 中國藥品標準， 2019， 20（3）： 224-230.

姬俊， 劉婷婷， 牛萌萌， 等. 卵磷脂和聚山梨酯-80聯用在中藥制劑抑菌活性中的中和作用[J]. 中國藥師， 2017， 20（3）： 586-588.

楊美琴， 蔡春燕， 劉鵬， 等. 鹽酸莫西沙星片微生物限度檢查方法討論[J]. 中國抗生素雜志， 2023， 47（3）： 245-251.

收稿日期：2024-12-06

作者簡介：劉鵬，男，生于1973年，副主任技師，從事藥品微生物檢定工作，E-mail： liupeng@nifdc.org.cn

*通信作者，E-mail： yangmeiqing@nifdc.org.cn

第一作者：劉鵬，男，于1973年，副主任技師。主要從事藥品微生物檢驗控制研究工作，多年來持續參與國家藥品抽查檢驗工作。參與多項微生物相關藥典通則標準提高項目及藥品注冊檢驗相關工作。承擔紅外光譜（FTIR）微生物相似性分析關鍵培養基研究、中藥飲片污染微生物數據庫的建立及微生物限度標準的研究、分子生物學分析方法在中藥微生物控制中的應用等工作。

通信作者：楊美琴，女，生于1982年，碩士，副主任藥師。主要從事藥品微生物檢驗控制工作，參與多項中國藥典微生物相關通則標準提高項目，以及中藥標準化建設等研究工作。