湖州市某三甲醫(yī)院住院患者艱難梭菌毒素基因檢測及其分子流行病學分析

摘要：目的 研究地市級醫(yī)院住院患者艱難梭菌感染的發(fā)生情況，并分析艱難梭菌的分子流行病學特征。方法 收集湖州市第一人民醫(yī)院2023年11月—2023年12月住院腹瀉患者糞便標本，培養(yǎng)分離艱難梭菌后，采用核酸擴增技術(shù)檢測毒素基因，菌株經(jīng)全基因測序后（Whole Genome Sequencing， WGS）進行分子流行病學分析。結(jié)果 從500份住院患者腹瀉樣本中分離得到49株艱難梭菌，其中產(chǎn)毒型艱難梭菌40株，艱難梭菌感染（Clostridium difficile infections， CDI）陽性率為8.00%；PCR檢測的毒素基因主要為tcdA（+）/tcdB（+），雙毒素基因陰性（A+B+CDT-），占97.50%（39/40），1株攜帶雙毒素基因（A+B+CDT+）；CDI陽性率最高的科室是消化內(nèi)科，其次為ICU；MLST分型中，共有13種ST型別，其中ST2型為優(yōu)勢型別，占30.00%；結(jié)合WGS數(shù)據(jù)分析，未發(fā)現(xiàn)艱難梭菌菌株在研究期間發(fā)生流行和傳播。結(jié)論 本院CDI在住院腹瀉患者中的發(fā)生率較低，未發(fā)生院內(nèi)感染傳播和暴發(fā)流行現(xiàn)象，但不排除存在未知感染源可能性，應重點關(guān)注重點科室，如ICU 患者發(fā)生CDI情況。

關(guān)鍵詞：住院患者；腹瀉；艱難梭菌；毒素基因；分子分型

中圖分類號：R9 文獻標志碼：A

Toxin gene detection and molecular epidemiology of Clostridioides difficile isolated from hospitalized patients in a tertiary hospital in Huzhou

Zheng Lili， Qiang Xinhua， and Ji Longfei

（Department of Laboratory Medicine， the First People's Hospital of Huzhou， Huzhou 313000）

Abstract Objective To study the incidence of Clostridioides difficile infection （CDI） in hospitalized patients in a tertiary hospital and analyze the molecular epidemiological characteristics of C. difficile. Methods Stool specimens from hospitalized patients with diarrhea in the First People’s Hospital of Huzhou City from November 2023 to December 2023 were collected. After C. difficile was isolated and confirmed， polymerase chain reaction （PCR） was used to detect the toxin genes. All toxigenic C. difficile isolates were sequenced by whole genomic sequencing （WGS） for molecular epidemiological analysis. Results From 500 diarrhea samples， 49 strains of C. difficile were isolated， of which 40 were toxin-gene positive strains， resulting in a CDI positivity rate of 8.00%. Isolates with tcdA-positive and tcdB-positive （A+B+CDT-） were the predominant toxinotyping， accounting for 97.50% （39 out of 40）， while one strain carried binary toxin genes （A+B+CDT+）. The department with the highest CDI positivity rate was gastroenterology， followed by the intensive care unit （ICU）. In multilocus sequence typing （MLST）， there were 13 different sequence types （ST）， among which ST2 was the dominant type， accounting for 30.00%. Combining WGS data analysis， there was no evidence of an epidemic or spread of C. difficile strains during the study period. Conclusion The incidence of CDI among hospitalized patients with diarrhea in our hospital was relatively low， and there was no occurrence of nosocomial transmission or outbreak. However， the possibility of an unknown source of infection cannot be ruled out， and attention should be focused on the occurrence of CDI in key departments， such as ICU patients.

Key words Hospitalized patients; Diarrhea; Clostridioides difficile; Toxin genes; Molecular typing

艱難梭菌（Clostridioides difficile， C. difficile），是一種專性厭氧的革蘭陽性芽胞桿菌，主要通過芽胞經(jīng)糞-口傳播[1]，可定植在人體腸道內(nèi)，屬條件致病菌[2]。艱難梭菌主要通過分泌毒素A和/或毒素B致病[3]。毒素A為腸毒素，可結(jié)合腸黏膜上皮細胞的毒素受體，介導環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate， cAMP）促進水鹽分泌，引發(fā)腸炎和腹瀉；毒素B為細胞毒素， 可直接破壞腸壁細胞引發(fā)炎癥反應，導致腸黏膜細胞變性、凋亡、壞死甚至脫落。部分產(chǎn)毒素菌株通過產(chǎn)雙毒素（CDT）引發(fā)疾病[4]。當腸道正常菌群因抗菌藥物使用等因素導致菌群抵抗降低，產(chǎn)毒素艱難梭菌過度繁殖并釋放大量毒素，引起艱難梭菌感染（C. difficile infection， CDI）。CDI是常見的住院患者院內(nèi)感染性腹瀉之一，臨床癥狀可從自限性腹瀉到假膜性結(jié)腸炎、中毒性巨結(jié)腸甚至感染休克死亡[5]。CDI是一種潛在的致命性疾病，世界范圍內(nèi)發(fā)病率都在不斷上升[6]。在我國，由于多數(shù)醫(yī)療單位并未開展艱難梭菌的常規(guī)臨床檢測[7]，且目前國內(nèi)已發(fā)表的艱難梭菌研究數(shù)據(jù)基本來源于一些大型綜合性教學醫(yī)院[8]，而基層醫(yī)院（地市級）對CDI的研究資料較為缺乏。本研究旨在了解地市級（湖州）醫(yī)院中，住院腹瀉患者艱難梭菌感染發(fā)生情況、感染患者的臨床基本特征、艱難梭菌分子流行病學特點等情況，為全面監(jiān)測我國CDI的真實情況進行補充。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2023年11月—2023年12月湖州市第一人民醫(yī)院入院48 h后發(fā)生腹瀉的住院患者糞便樣本，進行艱難梭菌培養(yǎng)和毒素檢測并收集其相關(guān)臨床資料。腹瀉判斷標準為：24 h內(nèi)腹瀉≥3次，糞便呈稀便、糊狀或水樣便等異常性狀[9]?；颊叱霈F(xiàn)腹瀉癥狀，同時糞便標本培養(yǎng)到艱難梭菌，且艱難梭菌tcdA和/或tcdB基因為陽性，并排除其他可能引起腹瀉的因素，診斷為CDI患者[10]。

收集CDI組患者發(fā)生腹瀉后首次送檢的臨床資料（包括白細胞計數(shù)、C反應蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、白蛋白和肌酐數(shù)值）；同時設(shè)立對照組，匹配年齡、性別和科室，患者發(fā)生腹瀉但艱難梭菌檢測為陰性的臨床資料進行統(tǒng)計分析，探討CDI臨床感染狀況。本方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審批通過。

1.2 方法

1.2.1 艱難梭菌分離培養(yǎng)及鑒定

收集來自湖州市第一人民醫(yī)院臨床住院患者發(fā)生腹瀉的送檢糞便樣本，取0.2～0.3 g（0.2～0.3 mL）左右的不成形糞便樣本浸泡于95%乙醇中，室溫靜置30 min后，置于離心機中以3000 r/min離心15 min，棄上清，加入生理鹽水0.5 mL并混勻。吸取適量的混合液加到選擇性培養(yǎng)基環(huán)絲氨酸-頭孢西丁-果糖瓊脂培養(yǎng)基（cycloserine-cefoxitin-fructose agar， CCFA）上，用涂布棒均勻涂布，置于Electrotek AW300SG厭氧工作站（厭氧環(huán)境：80%氮氣-10%二氧化碳-10%氫氣），37 ℃培養(yǎng)48～72 h觀察結(jié)果。挑選黃色或灰白色、扁平粗糙、邊緣不規(guī)則、有特殊臭味（馬糞味）的典型菌落，經(jīng)MALDI-TOF-MS（基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀）鑒定（score value≥2）為艱難梭菌的菌株于-80 ℃保存。

1.2.2 艱難梭菌毒素基因檢測

通過聚合酶鏈反應（PCR）檢測毒素基因tcdA、tcdB、cdtA和cdtB。引物序列[11]如表1所示。

1.2.3 艱難梭菌的全基因測序及分析

經(jīng)鑒定的產(chǎn)毒素艱難梭菌重新接種于哥倫比亞血瓊脂平板，37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h，用FastDNA Spin Kit試劑盒提取細菌的基因組，并送測序。全基因組（Whole genome sequences， WGS）數(shù)據(jù)在Illumina HiSeq 2500 系統(tǒng)（Illumina， San Diego， CA， USA）上進行。組裝前，使用FastQC v.0.11.5對原始序列讀數(shù)進行質(zhì)量控制[12]，并使用Trimmomatic v.0.40 對適配器區(qū)域進行修剪[13]。使用SPAdes v.3.6 15 對修剪后的讀數(shù)進行重新組裝[14]。

為了解產(chǎn)毒素艱難梭菌的種群結(jié)構(gòu)，將上述組裝好的基因組數(shù)據(jù)上傳至PubMLST官網(wǎng)，確定每株產(chǎn)毒素艱難梭菌的MLST分型[15]；并用Snippy基于參考序列Clostridioides difficile 630 （Accession： NC_009089.1）分析產(chǎn)毒素艱難梭菌菌株之間差異性突變位點，即單核苷酸多態(tài)性（SNP），并基于核心基因組用MAGE X構(gòu)建進化樹[16]。同時，基于核心基因組的SNP利用Cytoscape構(gòu)建最小生成樹[17]。為了深入研究艱難梭菌遺傳特征，使用Abricate v1.0.1軟件基于VFDB、Resfinder和CARD抗生素耐藥基因數(shù)據(jù)庫，對毒力基因和耐藥基因進行了分析[18]。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，對正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)，以（均數(shù)±標準差，x±s）表示，用t檢驗；對非參數(shù)計量數(shù)據(jù)，以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25，P75）]表示，用Mann-Whitney U檢驗。計數(shù)資料用例數(shù)（n）和百分率（%）表示，用χ2檢驗。Plt;0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CDI組患者的臨床基本情況

共收集腹瀉病例500例，其中男性患者278例（55.60%），女性患者222例（44.40%）；年齡≤65歲的有243例（48.60%），年齡＞65歲的有257例（51.40%）。一共分離鑒定得到艱難梭菌49株，培養(yǎng)陽性率為9.80%（49/500）。檢出產(chǎn)毒素艱難梭菌40株，結(jié)合患者臨床特征和CDI診斷標準，CDI陽性率為8.00%（40/500）。產(chǎn)毒艱難梭菌中，所有菌株毒素A和毒素B基因均陽性（A+B+），未檢測到毒素A陰性而毒素B陽性（A-B+）的菌株；在A+B+菌株中，僅有1株艱難梭菌檢測到雙毒素基因（A+B+CDT+）（2.50%， 1/40）。男性患者CDI陽性率為8.27%（23/278），女性患者CDI陽性率為7.66%（17/222）。年齡在65歲及以下患者中，CDI陽性率為7.40%（18/243）；年齡超過65歲患者中，CDI陽性率為8.56%（22/257）。不同年齡（年齡gt;65歲與年齡≤65歲）、不同性別住院患者CDI陽性率差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。CDI患者白細胞計數(shù)、C反應蛋白和肌酐值高于非CDI患者，而谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶和血清白蛋白值低于非CDI患者，統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn)，白細胞計數(shù)和血清白蛋白在兩組間差異有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05）；C反應蛋白、肌酐、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶在兩組間差異無統(tǒng)計學意義（均Pgt;0.05），詳見表2。所有CDI組患者經(jīng)治療后均好轉(zhuǎn)出院。

2.2 CDI組的標本來源及科室分布

500份住院腹瀉患者糞便標本來源于22個科室，其中培養(yǎng)到產(chǎn)毒素艱難梭菌的有19個科室，CDI患者陽性率最高的科室是消化內(nèi)科9例（14.52%，9/62），其次是ICU2例（10.00%，2/20）和神經(jīng)內(nèi)科3例（9.68%，3/31）。艱難梭菌科室培養(yǎng)陽性率及CDI陽性率詳見表3。

2.3 基因組測序分析結(jié)果

對40株產(chǎn)毒艱難梭菌進行MLST管家基因分析，共計得到13種ST型別，主要ST型別分別是ST2型12株（30.00%），ST35型、ST3型、ST54型和ST102型各占10.00%（4/40），其中產(chǎn)雙毒素艱難梭菌的型別為ST201型。對不同ST型別的艱難梭菌基因組進行分析，共發(fā)現(xiàn)11個耐藥基因，其中所有的產(chǎn)毒艱難梭菌均攜帶cdeA耐藥基因；AAC（6'）-Ie-APH（2''）-Ia、ANT（6）-Ia、ermB、ermQ、inuC、tetA（P）、tetB（P）和tet（M）等耐藥基因存在于個別艱難梭菌中。毒力基因分析發(fā)現(xiàn)一共有14個毒力基因，其中CD0873、CD2830、CD2831、cwp84、fbpA和groEL等毒力基因存在于所有產(chǎn)毒菌株中；CD3145、CD3246和cwp66毒力基因存在于大部分產(chǎn)毒艱難梭菌中；而slpA毒力基因僅存在于個別菌株中，詳見圖1。

基于核心組的SNP通過Cytoscape構(gòu)建最小生成樹，見圖2。按照≤3個SNP來分析[19]：3個以下的SNP，菌株來源于同一個克隆菌株；4～10個SNP表示菌株之間有關(guān)聯(lián)性，可能來源于同一個克隆菌株；大于10SNP表示菌株為獨立菌株。根據(jù)這個判斷標準，40株菌株中，34株為確定的獨立菌株，而剩下的6株菌株中，編號為500號的菌株與457號和480號菌株可能來自同一克隆，480號菌株與448號菌株可能來自同一克隆，206號與157號菌株可能也有所關(guān)聯(lián)，分析攜帶上述菌株患者的院內(nèi)活動軌跡，發(fā)現(xiàn)并不存在時空交叉感染，這表明未發(fā)現(xiàn)艱難梭菌在院內(nèi)傳播的情況。

3 討論

目前，CDI發(fā)生率呈現(xiàn)不斷上升趨勢[20]，在我國部分地區(qū)一些綜合醫(yī)院發(fā)生率也較高?？总驳萚21]研究發(fā)現(xiàn)，江蘇地區(qū)的兩所大中型醫(yī)院的高危人群艱難梭菌檢出率為31.15%（38/122），CDI陽性率為20.49%（25/122）。朱曉艷等[22]收集了四川某大型綜合醫(yī)院810例腹瀉糞便標本進行篩查，其中艱難梭菌的檢出率為16.79%（136/810），CDI陽性率為9.75%（79/810）。本研究收取了湖州市第一人民醫(yī)院500例住院患者腹瀉樣本進行培養(yǎng)，共分離艱難梭菌49株，檢出率為9.80%；分離出產(chǎn)毒型艱難梭菌40株，結(jié)合患者臨床診斷，CDI陽性率為8.00%。與上述大型綜合醫(yī)院相比，地市級醫(yī)院艱難梭菌檢出率及陽性率略有偏低，可能是與研究對象非高危人群、收集時間短樣本量少、檢測方法不同等原因相關(guān)[23]。本研究中，CDI患者來源于19個科室，分布較為廣泛，陽性率最高的是科室是消化內(nèi)科，可能是消化內(nèi)科患者由于胃腸道疾病等原因容易引起胃腸黏膜屏障被破壞[24]，導致艱難梭菌易感；同時也可能是消化科醫(yī)生對CDI的認知度較高，對發(fā)生腹瀉的患者會考慮進行艱難梭菌的檢測。在本研究中，ICU患者CDI陽性率低于消化內(nèi)科患者，而有相關(guān)研究[25-27]表明，ICU患者由于病情較重、合并基礎(chǔ)疾病較多、部分患者長期聯(lián)合使用抗菌藥物等原因，大大增加了感染艱難梭菌的風險，這提示在后續(xù)的研究中應重點關(guān)注ICU患者CDI的情況，包括對ICU醫(yī)生進行CDI的宣教。

本研究中，產(chǎn)毒素艱難梭菌分離率為81.63%，介于國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)的72.00%～92.00%之間[28]，其中A+B+是產(chǎn)毒素艱難梭菌最主要的毒素型別，這與國內(nèi)外的相關(guān)研究數(shù)據(jù)相一致[29]。需注意的是，本研究中還檢出1株A+B+CDT+的艱難梭菌菌株，經(jīng)MLST分型鑒定為ST201型，該ST型并非國外較為流行的高毒力艱難梭菌RT027型（ST1型）[30]和RT078型（ST11型）[31]，但與ST1型艱難梭菌高度同源[32]，雖未在國內(nèi)外引起暴發(fā)流行，僅有少數(shù)相關(guān)報道[33-34]，仍應密切關(guān)注該種菌株的流行和傳播。

有研究指出，年齡（gt;65歲）、白細胞值升高、腎功能衰竭和潛在合并癥是復雜CDI常見危險因素[35]，而血清白蛋白是可以預測CDI死亡率和疾病并發(fā)癥及復發(fā)的實驗室指標[36]。由于本研究為回顧性研究，臨床醫(yī)生缺乏對CDI的了解，對多數(shù)患者只是進行了止瀉處理，所有患者病情經(jīng)好轉(zhuǎn)后出院，未發(fā)生死亡事件。后續(xù)是否存在CDI的復發(fā)，還需進一步追蹤和隨訪。本研究中，CDI組與非CDI組患者的相關(guān)實驗室指標統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，CDI組白細胞計數(shù)高于非CDI組，白蛋白水平低于非CDI組，差異均有統(tǒng)計學意義。究其原因，考慮產(chǎn)毒型艱難梭菌在腸道中釋放毒素，引起白細胞浸潤和炎癥因子聚集，引發(fā)腸道炎癥反應[37]，導致白細胞數(shù)值升高。白蛋白作為一種負性急性期反應蛋白，與炎癥組織呈負相關(guān)[38]，在CDI嚴重感染時，由于腸通透性增加，蛋白質(zhì)大量損失，甚至出現(xiàn)腸假膜[39]。本研究關(guān)于兩組在腎臟功能（肌酐）的比較中，差異無統(tǒng)計學意義，且CDI組肌酐指標均未超過重度標準（血肌酐≥1.5 mg/dL）[10]，這說明CDI組患者感染癥狀并不嚴重。有研究[40]顯示，年齡超過65歲也是CDI的危險因素之一，推測是與老年人的免疫力低、腸道菌群抵抗力下降等有關(guān)。但在本研究中，CDI發(fā)生率在超過65歲和小于65歲患者中并無統(tǒng)計學意義，可能是在收集樣本過程中，未將兒科的樣本剔除，導致整體年齡分布趨于年輕化。

細菌分子分型是用來監(jiān)測CDI暴發(fā)和流行病學溯源的一種重要技術(shù)。本研究中所有的產(chǎn)毒型艱難梭菌經(jīng)MLST分型后得到13種ST型，主要型別為ST2型，與國內(nèi)現(xiàn)有的研究報道[41-42]大型綜合醫(yī)院的主要流行菌株為ST54型、ST35型等不同，這可能與大型綜合醫(yī)院的患者多數(shù)由于病情復雜、住院時間長，出現(xiàn)院內(nèi)感染的可能性較高有關(guān)。研究報道稱[43]，ST2型艱難梭菌感染往往是社區(qū)來源，而地市級醫(yī)院接診的患者大多為社區(qū)首診，這就造成了艱難梭菌ST型別在不同等級醫(yī)院上的差異。對40株產(chǎn)毒艱難梭菌進行耐藥基因檢測發(fā)現(xiàn)，所有菌株均攜帶cdeA耐藥基因，它是艱難梭菌中被發(fā)現(xiàn)的首個多種藥物外排轉(zhuǎn)運體，會導致艱難梭菌對喹諾酮類和吖啶酮類藥物產(chǎn)生耐藥性[44]。氨基糖苷類和大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因主要富集在ST35型、ST3型艱難梭菌等，其他類型耐藥基因無明顯聚集，呈多樣性分布。毒力基因檢測中，cwp（細胞壁或艱難梭菌壁蛋白）、fbpA（纖維連接蛋白）、groEL（熱休克蛋白）等蛋白基因，存在于所有產(chǎn)毒艱難梭菌中，其與艱難梭菌致病力有關(guān)，可以參與細菌黏附、侵襲、運動和定植等[45]。

基于WGS的數(shù)據(jù)和核心基因組的SNP構(gòu)建最小生成樹，可以判斷流行菌株是否來自同一個克隆菌株[46]。本研究中，40株產(chǎn)毒艱難梭菌大多數(shù)都是獨立進化，沒有發(fā)生院內(nèi)傳播，可能是患者在入院前已攜帶產(chǎn)毒菌株[47]。在最小生成樹中發(fā)現(xiàn)1個關(guān)系較為緊密的分支（clade），兩兩菌株之間的SNP在8～10之間，結(jié)合患者臨床資料分析，并沒有發(fā)現(xiàn)這些患者在時間、空間上有交叉感染的情況，推測可能是存在其他未知的傳染源。由于CDI患者或無癥狀艱難梭菌定植患者會不斷排出帶有艱難梭菌的糞便，其牙胞可在環(huán)境中存活6個月以上[48]，污染醫(yī)院環(huán)境、物體表面、醫(yī)療設(shè)備以及醫(yī)務(wù)工作者的衣物等[49]，因此，規(guī)范的手衛(wèi)生、嚴格消毒院內(nèi)環(huán)境和醫(yī)療設(shè)備、定期更換病房用品等措施有助于減少艱難梭菌的感染與傳播[50]。

需要說明的是，本研究還存在著一定不足之處，首先是收集樣本時間較短、樣本量較少；其次由于客觀原因未將CDI危險因素（使用抗生素、住院時長、合并并發(fā)癥等）納入統(tǒng)計分析，導致CDI患者臨床信息分析不夠全面，不足之處將在后續(xù)研究中加以改善。

綜上所述，湖州市第一人民醫(yī)院CDI陽性率與國內(nèi)一些大型綜合醫(yī)院相比偏低，分子分型也略有差異，盡管未發(fā)現(xiàn)艱難梭菌的院內(nèi)感染暴發(fā)流行，但未知的感染源仍應引起我們的重視，我們要繼續(xù)加強對CDI的監(jiān)測和感控。

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