魚腥草內生放線菌Streptomyces sanglieri GZWMJZ-725次級代謝產物及其α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

摘要：目的 對魚腥草內生鏈霉菌Streptomyces sanglieri GZWMJZ-725的次級代謝產物及α-葡萄糖苷酶抑制活性進行研究。方法 采用大米固體培養基對菌株進行發酵；采用有機溶劑對發酵產物進行提取；利用正反相柱色譜手段對提取物進行分離純化；綜合運用高分辨質譜、核磁共振波譜、紫外、紅外等現代波譜技術對化合物平面結構進行解析；采用計算圓二色譜法確定化合物的立體構型；采用pNPG法測試化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性。結果 從S. sanglieri GZWMJZ-725發酵產物中分離到3個化合物，其中化合物1和2鑒定為新的protoasukamycin類似物，化合物3為protoasukamycin。化合物1～3對α-葡萄糖苷酶的半數抑制濃度（IC50）分別為（10.08±0.09）、（10.71±0.18）和（11.14±0.18） μg/mL，陽性對照阿卡波糖的IC50為（140.78±1.98） μg/mL。結論 魚腥草內生鏈霉菌S. sanglieri GZWMJZ-725可產生結構新穎且具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的protoasukamycin類化合物。

關鍵詞： 內生放線菌；次級代謝產物；結構鑒定；α-葡萄糖苷酶

中圖分類號：R978.1 文獻標志碼：A

Secondary metabolites and their α-glucosidase inhibitory activity from Streptomyces sanglieri GZWMJZ-725， an endophytic actinomyces from Houttuynia cordata Thunb.

Li Mingxing1，2， Wang Liping1，2 ， Xu Yanchao1， Wu Dan1，2， Wang Dongyang 1，2， and Zhu Weiming1，3

（1 State Key Laborataory of Functions and Applications of Medicinal Plants， Guizhou Medical University， Guiyang 550014；

2 "Natural Products Research Center of Guizhou Province， Guiyang 550014; 3 School of Medicine and Pharmacy，

Ocean University of China， Qingdao 266003）

Abstract Objective To investigate the secondary metabolites of endophytic Streptomyces sanglieri GZWMJZ-725 from Houttuynia cordata Thunb and their α-glucosidase inhibition activity. Methods Rice solid culture medium was used to ferment the strains. Organic solvents were used to extract the fermentation products， and the fermentation products were separated and purified using normal and reverse-phase silica gel column chromatography. Modern spectroscopic techniques such as high-resolution mass spectrometry， nuclear magnetic resonance spectroscopy， ultraviolet spectroscopy， and infrared spectroscopy were comprehensively applied to analyze the planar structures of the compounds. Experimental and calculated electronic circular dichroism spectroscopy was employed to determine the stereo-configuration of the compound. The inhibitory activities against α-glucosidase were assayed by the p-nitrophenyl-β-glucopyranoside method. Results Three compounds were isolated from the fermentation products of S. sanglieri GZWMJZ-725， among which compounds 1 and 2 were identified as new protoasukamycin analogues， while compound 3 was identified as protoasukamycin. Compounds 1～3 showed significant inhibitory activities against α-glucosidase， with half inhibitory concentration （IC50） values of 10.08±0.09， （10.71±0.18）， and （11.14±0.18） μg/mL， respectively. The IC50 value of acarbose was found to be 140.78±1.98 μg/mL. Conclusion The endophytic S. sanglieri GZWMJZ-725 isolated from Houttuynia cordata Thunb. can produce structurally novel protoasukamycin analogs with α-glucosidase inhibitory activity.

Key words Endophytic actinomyces; Secondary metabolites; Structural identification; α-Glucosidase

自20世紀40年代青霉素和鏈霉素相繼被發現以來，研究人員從不同的微生物代謝產物中發現了大量具有生物活性的代謝產物[1]，并以此為基礎開發出了多種抗生素，如霉酚酸鈉、他克莫司和莫匹羅星等。隨著對普通生態環境下微生物及其次級代謝產物的研究，產物的重復分離和鑒定成了制約新型抗生素發現的瓶頸，近些年對植物內生菌的研究為探索微生物來源抗生素資源提供了新的渠道[2]。根據共生理論，植物內生菌可以產生與宿主植物相同或者相似的代謝產物，此外植物內生菌所處的獨特生存環境，有時會產生獨特的次級代謝產物[3]。因此，對植物內生菌次級代謝產物的持續挖掘有望獲得結構新穎的活性產物。

魚腥草（Houttuynia cordata Thunb.）廣泛分布于亞洲各國，是一種收錄于中國藥典的草藥，同時也是一種深受云、貴、川等地人民喜愛的食物[4]。已有研究表明魚腥草中含有豐富的內生微生物[5]，但對其內生微生物次級代謝產物的分離和鑒定卻鮮有報道。為了研究魚腥草內生菌產生的具有生物活性的新穎次級代謝產物，本課題組對采集自貴州省黔南布依族苗族自治州龍里縣的魚腥草植株中的內生菌進行了分離，并已從兩株內生真菌中得到了多個具有抑菌或細胞毒活性的化合物[6-7]。在對其持續研究過程中，從1株內生放線菌Streptomyces sanglieri GZWMJZ-725的發酵物中分離并鑒定了2個protoasukamycin類似物（1～2）和protoasukamycin（3）。雖然3個化合物在多篇文章中均有提及，但僅有1篇文獻對化合物3進行了全合成[8]，有關化合物1和2的結構研究僅停留在對asukamycin生物合成中間體液質聯用分析圖上相關離子峰的推測層面[9-10]，未見有其他數據的報道。活性測試發現3個化合物均具有強于陽性藥阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性。

1 實驗部分

1.1 實驗儀器與試劑

實驗儀器：核磁共振波譜儀Avance Neo 600M（德國Bruker公司）；高分辨質譜儀Q ExactiveTM Focus（美國ThermoFisher公司）；分析及半制備型高效液相色譜儀Primaide 1430二極管陣列檢測器，1110四元高壓泵（日本Hitachi公司）；全自動旋光儀MCP5100（奧地利Anto Paar公司）；圓二色譜儀J-1500（日本Jasco公司）；快速液相制備色譜及配套ODS分離柱SepaBean machine T（常州三泰科技有限公司）；半制備ODS-A及C8色譜柱（10 mm×250 mm，5 μm，北京綠百草科技發展有限公司）；高壓蒸汽滅菌機LDZX-75KBS（上海申安醫療器械廠）；恒溫震蕩培養箱ZWY-2112B（上海智城分析儀器制造有限公司）。

試劑：發酵用大米（金龍魚東北大米）；培養基配制原材料（北京奧博星生物技術有限責任公司）；柱色譜及薄層色譜用硅膠H（分析純，青島譜科分離材料有限公司）；提取分離用乙酸乙酯、甲醇、二氯甲烷、石油醚等（分析純，上海沃化化工有限公司）；液相用水（杭州娃哈哈集團有限公司）；液相用甲醇及四氫呋喃（色譜純，上海星可高純溶劑有限公司）。

1.2 實驗菌株

菌株GZWMJZ-725分離自采集于貴州省黔南布依族苗族自治州龍里縣的新鮮魚腥草根莖，保藏于貴州省天然產物研究中心。經16S rRNA測序、NCBI數據庫進行比對，鑒定為桑格利娜氏鏈霉菌（Streptomyces sanglieri），GenBank登錄號為No. PP086778。

1.3 菌株發酵和提取

將生長于ISP2固體培養基（4.0 g酵母浸粉，10.0 g麥芽浸粉，4.0 g葡萄糖，20.0 g瓊脂粉，1.0 L水）上的單菌落接種到相同液體培養基中（不含瓊脂），置于28 ℃恒溫震蕩培養箱（180 r/min）中培養3 d作為發酵種子液。無菌吸管吸取6 mL種子液接入經滅菌的培養袋中，每袋包含有50 g大米、10 g黃豆粉、0.25 g氯化鈉和50 mL水；常溫（25 ℃～30 ℃）發酵30 d，共發酵1000袋。培養完成后將培養物倒出并加入20 L含有10%甲醇的乙酸乙酯（V：V）攪拌1 h后倒出有機溶劑，重復提取3遍，合并有機提取液并將有機溶劑濃縮至干；接著將油狀提取物混懸于甲醇中，采用石油醚洗滌除去大量的油脂，甲醇層減壓濃縮得到提取物285.6 g。

1.4 代謝產物分離

提取物首先經過正相硅膠柱色譜分離，采用100：1～0：1（V：V）的二氯甲烷甲醇溶液梯度洗脫，經過TLC檢測合樣最終得到20個組分（Fr.1～20）。用純甲醇對Fr.15（6.0 g）進行洗滌，得到不溶物262 mg；不溶物經反相C8柱色譜分離得到Fr.15.1（54 mg）和Fr.15.2（31 mg），洗脫劑為含0.15%三氟乙酸的四氫呋喃水溶液（V：V= 1：1）。Fr.15.1采用半制備HPLC在C8色譜柱上純化得到化合物1（tR=26.2 min，14.2 mg），洗脫劑為55%四氫呋喃水溶液（含0.05%三氟乙酸，

3 mL/min）；Fr.15.2在半制備ODS-A色譜柱上采用85%甲醇水（0.05%三氟乙酸，4 mL/min）洗脫得到化合物3（tR=25.0 min，7.5 mg）。用純甲醇對Fr.18（26.7 g）進行洗滌，得到不溶物1.8 g；不溶物經反相C8柱色譜分離得到Fr.18.1（36 mg）和Fr.18.2（871 mg），洗脫劑為含0.15%三氟乙酸的四氫呋喃水溶液（V：V= 1：1）。59 mg的Fr.18.2在半制備C8色譜柱上純化得到組分Fr.18.2.1（tR=25.2 min，7 mg），采用52%四氫呋喃水溶液洗脫（含0.05%三氟乙酸，3 mL/min）。Fr18.2.1在半制備ODS-A色譜上經4 mL/min的80%甲醇水（含0.05%三氟乙酸）洗脫得到化合物2（tR=22.0 min，5.5 mg）。

1.5 活性評價方法

采用了p-nitrophenyl-β-glucopyranoside（pNPG）法測試了化合物的α-葡萄糖苷酶抑制活性，阿卡波糖作為陽性對照。測試方法與之前報道相同[11]。

2 結果與分析

2.1 化合物結構鑒定（圖1～3）

化合物1：黃色固體。高分辨質譜在m/z 489.2368

處給出準分子離子峰（Calcd. [M+H]+ 489.2384），提示化合物1的分子式為C29H32N2O5，不飽和度為15。比旋光度為[α]D25 +104.4（c 0.03，THF）；ECD（c 1 mmol/L，DMSO）λmax（Δε） 241（-31.7），310（-63.3），334（-17.4），348（+4.6），360（-13.4），378（-12.7），398（+21.2）nm；紫外光譜λmax（logε）在319（4.29）、385（4.22） nm處有吸收；紅外光譜（KBr）顯示化合物在3446、2923、1616、1541、1507、1436、1386、1150和1004 cm-1處的吸收峰提示可能含（亞）甲基、酚羥基、酰胺等結構。其1H、13C和HSQC譜給出2個甲基（δC 11.6、19.6）、1個sp3亞甲基（δC 29.0）、1個sp3次甲基（δC 38.0）、15個sp2次甲基（δC 116.0、120.5、120.7、123.9、124.0、125.9、128.5、128.6、129.2、136.8、140.2、141.0、141.8、142.8、144.7）、7個sp2季碳（δC 115.0、126.8、127.8、148.7、164.4、166.3、189.0）。與分子式對比發現碳譜中缺少3個碳信號，但根據已知數據確定化合物結構與手霉素類化合物protoasukamycin（3）比較接近[8]，由于手霉素類化合物中2-氨基-3-羥基環戊-2-烯酮部分核磁信號普遍較弱，結合化合物的分子式確定化合物中應存在2-氨基-3-羥基環戊-2-烯酮片段[10， 12]。在HMBC譜中，1-OH（δH 10.36）與C-1相關、2-NH（δH 9.46）與C-3/C-1'相關、H-3（δH 8.04）與C-4/C-7相關、H-5（δH 7.15）與C-1/C-4/C-7相關、H-6（δH 6.87）與C-2相關、H-7（δH 6.72）與C-8相關、H-8（δH 6.83）與C-9/C-10相關、H-9（δH 6.86）與C-8相關、H-11（δH 7.28）與C-13相關、H-12（δH 6.54）與C-10相關、13-NH（δH 9.95）與C-13/C-2\"相關、H-2?（δH 6.46）與C-1'相關；在1H-1H COSY譜中H-9/H-10（δH 6.50）之間有相關信號、H-11/H-12之間有相關信號、H-2?/H-3'（δH 7.21）/H-4'（δH 6.36）/H-5'（δH 6.65）/H-6'（δH 6.20）/H-7'（δH 5.85）/H-8'（δH 2.11）/H2-9'（δH 1.33）/H3-10'（δH 0.83）之間有相關信號、H-8'/H3-11'（δH 0.99）之間有相關信號，證明了化合物其他位置與protoasukamycin（3）相同，而7'-位連接基團為仲丁基。化合物1中雙鍵兩端氫的耦合常數均大于12 Hz（表1），可確定兩條鏈上均為E型雙鍵。為了確定化合物中C-8'的絕對構型，分別對R和S兩種構型的ECD數據進行了計算，結果顯示化合物1的實測ECD曲線與S構型的計算結果相符（圖3），化合物1的絕對構型被確定為S。

化合物2：黃色固體；高分辨質譜在m/z 475.2220處給出[M+H]+準分子離子峰（cacld. [M+H]+ 475.2228），提示化合物2的分子量為474，分子式為C28H30N2O5，不飽和度為15。紫外光譜λmax（logε）在316（4.35）、384（4.40） nm處有吸收，紅外光譜（KBr）顯示化合物在3406、2962、1610、1540、1506、1386、1262、1147、1104、1005、804 cm-1處的吸收峰提示可能含（亞）甲基、酚羥基、羰基、酰胺等基團。分析其1H、13C和HSQC譜確定化合物含2個甲基（δC 22.0、22.0）、1個sp3次甲基（δC 30.9）、15個sp2次甲基（δC 116.1、120.6、120.8、124.0、124.1、125.9、127.4、128.7、129.2、136.9、140.3、141.1、141.9、142.9、146.1）、6個sp2季碳（δC 115.0、126.9、127.9、148.8、164.5、166.3）（表1）。以上數據與化合物1的數據相似，且同樣缺少2-氨基-3-羥基環戊-2-烯酮片段的碳信號。與化合物1主要區別在于7'-位連接的烷基不同。在HMBC譜中，2-NH（δH 9.47）與C-2/C-3/C-1'相關、H-3（δH 8.04）與C-2/C-5/C-7相關、H-5（δH 7.15）與C-7相關、H-6（δH 6.86）與C-1/C-2/C-4相關、H-7（δH 6.72）與C-8/C-9相關、H-11（δH 7.27）與C-13相關、H-12（δH 6.53）與C-10/C-13相關、13-NH（δH 9.94）與C-13相關、H-2'（δH 6.45）/H-3'（δH 7.21）與C-1'相關（圖2）；在1H-1H COSY譜中H-9/H-10之間有相關信號、H-11/H-12之間有相關信號、H-2'/H-3'/H-4'（δH 6.37）/H-5'（δH 6.64）/H-6'（δH 6.18）/H-7'（δH 5.94）/H-8'（δH 2.38）/H3-9'amp;10'（δH 1.00）之間有相關信號（圖2），證明化合物在7'-位連接著一個異丙基。化合物2的兩條共軛多烯鏈上各雙鍵間的耦合常數同樣均大于12 Hz（表1），說明結構中的雙鍵均為E型。至此，化合物2的結構得以確定。

化合物3：黃色固體；高分辨質譜在m/z 537.2349處給出[M+Na]+準分子離子峰（calcd. [M+Na]+ 537.2360），提示化合物3的分子量為514，分子式為C31H34N2O5，不飽和度為16。紫外光譜λmax（logε）在317（4.37）、382（4.30）nm處有吸收，紅外光譜（KBr）顯示化合物在3446、2925、1628、1541、1507、1435、1386、1004 cm-1處的吸收峰提示可能含（亞）甲基、羥基、酰胺、苯等結構。1H NMR（600 MHz，DMSO-d6）δH 13.97（1H，s，3\"-OH），10.33（1H，s，1-OH），9.97（1H，s，13-NH），9.46（1H，s，2-NH），8.04（1H，s，H-3），7.28（1H，dd，J=14.9，11.6 Hz，H-11），7.20（1H，dd，J= 14.9，11.5 Hz，H-3?），7.15（1H，dd，J=8.3，1.4 Hz，H-5），6.88（1H，dd，J=14.7，10.8 Hz，H-8），6.86（1H，d，J=8.3 Hz，H-6），6.84（1H，dd，J= 13.8，10.8 Hz，H-9），6.72（1H，d，J=14.7 Hz，H-7），6.64（1H，dd，J=4.9，10.6 Hz，H-5'），6.54（1H，d，J=14.9 Hz，H-12），6.50（1H，dd，J=13.8，11.6 Hz，H-10），6.45（1H，d，J=14.9 Hz，H-2?），6.36（1H，dd，J=14.9，11.5 Hz，H-4'），6.19（1H，dd，J=15.3，10.6 Hz，H-6'），5.91（1H，dd，J=15.3，7.0 Hz，H-7'），2.43（4H，s，H-4??/5??），2.10～2.04（1H，m，H-8'），1.74～1.65（4H，m，H2-10'amp;12'），1.30～1.21（2H，m，H2-11'），1.19～1.05（4H，m，H2-9'amp;13'）。13C NMR（150 MHz，DMSO-d6）δC 166.3（C-13），164.4（C-1'），148.7（C-2），144.8（C-7'），142.9（C-11），141.8（C-9），141.0（C-3'），140.4（C-5'），136.8（C-7），129.2（C-10），128.6（C-4'），127.8（C-4），127.7（C-6'），126.8（C-1），125.9（C-8），124.0（C-2'），123.9（C-5），120.7（C-12），120.6（C-3），116.0（C-6），115.0（C-2\"），40.4（C-8'），32.1（C-9'），25.6（C-11'），25.4（C-10'）。以上與文獻報道基本一致[8]，故鑒定化合物3為protoasukamycin。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制測試結果

采用pNPG法測試了化合物1～3和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性，IC50值分別為（10.08±0.09）、（10.71±0.18）、（11.14±0.18）和（140.78±1.98） μg/mL。

3 結論與討論

世界衛生組織網站相關數據顯示，僅2019年全世界大約有200萬人死于糖尿病及其并發癥。對2000—2019年期間4種主要非傳染性疾病（心血管疾病、癌癥、慢性呼吸道疾病和糖尿病）造成的死亡數據統計顯示，只有糖尿病的致死率有所提升，特別是在中低收入國家糖尿病的致死率高達13%，急需開發新的治療藥物或手段去抑制這一升高趨勢。治療2型糖尿病的α-葡萄糖苷酶抑制劑可減緩食物中多糖降解為單糖的過程，延遲小腸對葡萄糖的吸收從而起到降血糖作用[13]。由于α-葡萄糖苷酶抑制劑的作用機制不依賴胰島素，安全性好，特別適合我國高碳水飲食的2型糖尿病人群[14]，開發新型α-葡萄糖苷酶抑制劑可有效緩解餐后高血糖對糖尿病患者造成的不良影響。由于阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖等臨床用抑制劑均直接或間接來源于微生物的代謝產物，從微生物代謝產物中尋找新的α-葡萄糖苷酶抑制劑具有獨特優勢。本文從魚腥草內生鏈霉菌S. sanglieri GZWMJZ-725的固體發酵產物中分離得到3個protoasukamycin類化合物。從結構來看，化合物1～3均為手霉素類化合物的生物合成中間體，但是文獻中化合物1和2的結構僅根據生物合成途徑及菌株發酵產物液質聯用分析譜圖中的相關數據推測確定[9-10]；在相同文獻中作者也對化合物3在asukamycin的代謝過程中的相關高分辨質譜進行了指認，另外Hu等[8]對13C標記的化合物3進行了全合成。本文首次對化合物1和2的結構進行了全面的波譜解析。在活性方面，3個化合物均表現出強于阿卡波糖的α-葡萄糖苷酶抑制活性，為α-葡萄糖苷酶抑制劑的開發提供了一種新的候選結構類型。

參 考 文 獻

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