鏈霉菌Streptomyces sp. CPCC 203679的次級代謝產物研究

摘要：目的 研究鏈霉菌Streptomyces sp. CPCC 203679的活性次級代謝產物，分析其次級代謝產物生物合成基因簇，并挖掘其產生次級代謝產物的潛力。方法 通過正相硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜和半制備HPLC等方法進行分離純化。利用質譜、核磁共振波譜等技術進行化合物的結構鑒定。利用Illumina HiSeq測序技術對菌株CPCC 203679進行基因組測序，采用antiSMASH（v7.1.0）在線工具分析其次級代謝產物生物合成基因簇。對大環內酯類化合物進行抗病毒和抗菌活性測試。結果 從鏈霉菌CPCC 203679發酵液中分離鑒定了4個化合物，分別為： 勃利霉素A（1）、勃利霉素F（2）、5'-脫氧-5'-甲硫肌苷（3）、環（L-丙氨酸-L-異亮氨酸）二肽（4）?；衔?和2顯示良好的抗甲型流感病毒活性，IC50值分別為2.4和4.7 μmol/L，化合物1還顯示一定的抗革蘭陽性菌和抗結核分枝桿菌活性。全基因組測序顯示，菌株CPCC 203679的基因組序列全長8，055，535 bp，平均（G+C）含量為72.58%，共編碼7507個基因，預測到44個生物合成基因簇。結論 從鏈霉菌Streptomyces sp. CPCC 203679中分離得到2個活性良好的大環內酯類化合物，并首次報道了勃利霉素類大環內酯的抗甲型流感病毒、抗艾滋病病毒和抗結核分枝桿菌的活性。該菌株具有豐富的次級代謝產物生物合成基因簇，具有進一步挖掘新的次級代謝產物的價值。

關鍵詞：鏈霉菌；次級代謝產物；抗病毒活性；抗菌活性；全基因組測序

中圖分類號：R978 文獻標志碼：A

Study on secondary metabolites from Streptomyces sp. CPCC 203679

Guo Zhe1， Liu Meng2，3， Zhao Jianyuan1， Hu Xinxin1， Xu Jian1，4， Bai Jinglin1，

Cen Shan1， You Xuefu1， Yu Liyan1， and Zhang Dewu1

（1 Institute of Medicinal Biotechnology， Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College， Beijing 100050; 2 College of Applied Arts and Science， Beijing Union University， Beijing 100023; 3 Beijing Children’s Hospital， Capital Medical University， Beijing 100045; 4 Beijing Key Laboratory of Drug Resistance Tuberculosis Research， Beijing Tuberculosis and Thoracic Tumor Research Institute， Beijing Chest Hospital， Capital Medical University， Beijing 101149）

Abstract Objective To investigate bioactive secondary metabolites from Streptomyces sp. CPCC 203679， analyzed the biosynthesis gene cluster of secondary metabolites， and explored its potential to produce secondary metabolites. Methods The secondary metabolites were isolated and purified by silica gel column chromatography， Sephadex LH-20 column chromatography and semi-preparative HPLC. Their structures were elucidated by extensive spectroscopic analyses， such as mass spectrum and NMR. Streptomyces sp. CPCC 203679 was sequenced by Illumina HiSeq sequencing technology to mine secondary metabolite biosynthesis gene clusters using antiSMASH （v7.1.0） online tool. The isolated macrolides were evaluated for their antiviral and antibacterial activities. Results Four compounds were isolated from the fermentation broth of Streptomyces sp. CPCC 203679 and elucidated as borrelidin A （1）， borrelidin F （2）， 5'-deoxy-5'-methylthioinosine （3）， and cyclo-（L-Ala-L-Ile） （4）. Compounds 1 and 2 showed significant anti-influenza A virus （IAV） activities， with IC50 values of 2.4 and 4.7 μmol/L， respectively. Compound 1 also displayed broad-spectrum activities against Gram-positive bacteria and Mycobaeterium tuberculosis. Whole-genome sequencing revealed that the size of the genome was 8，055，535 bp with an average G+C content of 72.58%， which encoded 7507 genes， and a total of 44 biosynthetic gene clusters were predicted. Conclusion "Two bioactive macrolides were obtained from the fermentation broth of Streptomyces sp. CPCC 203679. The anti-IAV， anti-HIV， and anti-Mycobacterium tuberculosis activities of borrelidin derivatives were reported for the first time. This strain has abundant secondary metabolite biosynthesis gene clusters， which has the value of further exploring new secondary metabolites.

Key words Streptomyces; Secondary metabolites; Antiviral activity; Antibacterial activity; Whole genome sequencing

放線菌是發現新型微生物藥物的重要資源[1]。鏈霉菌屬Streptomyces為放線菌的優勢屬，在自然界分布廣泛，在與自然環境的作用過程，鏈霉菌能夠產生具有多種生物學活性的次級代謝物，如抗真菌藥物、抗病毒藥物、抗腫瘤藥物、抗高血壓藥物和免疫抑制劑等[2]。隨著基因測序技術的發展，發現鏈霉菌中含有豐富的次級代謝產物生物合成基因，結合生物信息學分析，可以預測其次級代謝產物生物合成基因簇，為深入挖掘鏈霉菌中的次級代謝產物提供了新的方法和思路[3]。本研究對一株來源于土壤的活性鏈霉菌進行研究，從其液體發酵產物中分離得到4個化合物（圖1），其中化合物1顯示了良好的抗病毒和抗菌活性。進一步結合全基因組測序技術，對其產生次級代謝產物的潛力進行了深入挖掘。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）；超凈工作臺（美國Nuaire公司）；生化培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；旋轉蒸發儀（瑞士Buchi公司）；CombiflashRf200快速純化制備液相色譜（美國Teledyne Isco公司）；Agilent 1290高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Agilent 1100高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；Thermo LTQ質譜儀（美國Themo公司）；核磁共振儀（瑞士Bruker公司）；電泳儀 JY200C（北京君意）；凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司）；臺式常溫離心機（德國Eppendorf公司）；可調移液器（德國Eppendorf公司）；NanoDrop 2000分光光度計（美國Thermo公司）。200～300目柱層析硅膠（青島海洋化工廠）；Sephadex LH-20（美國GE Helthcare公司）。甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正己烷、正丁醇、色譜乙腈、色譜甲醇、甘油（北京通廣精細化工公司）；酵母粉（英國Oxoid公司）；瓊脂（Kehbio分裝）；葡萄糖、可溶性淀粉、酵母膏、麥芽粉、麥芽膏、葡萄糖（北京奧博星生物技術有限公司）；硫酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、碳酸鈣（上海源葉生物）；細菌DNA提取試劑盒（北京全式金生物技術股份有限公司）。

1.2 菌株

菌株CPCC 203679由本實驗室分離自浙江省杭州西溪濕地的土壤，通過對其16S rRNA基因測序發現其序列與菌株Streptomyces rochei NRRLB 2410（T）、Streptomyces enissocaesilis NRRLB-16365（T）、Streptomyces plicatus NBRC 13071（T）的序列相似度均為99.86%，現保藏于中國藥學微生物菌種保藏管理中心。本實驗抗菌活性測試的所有檢定菌均保藏于中國醫學科學院醫藥生物技術研究所藥理研究室。

1.3 菌株發酵

將菌株CPCC 203679從甘油管中接種于YM斜面培養基，置于28 ℃恒溫箱培養8～10 d。將生長狀態良好的斜面接種于發酵培養基（100 mL培養基/500 mL三角瓶）中，28 ℃振蕩培養48 h得到種子液，然后以5%濃度（V/V）接入5 L發酵瓶（1 L培養基/5 L發酵瓶）中，28 ℃

震蕩培養96 h得到最終發酵液10 L。

YM斜面培養基：酵母粉 0.4%，麥芽粉 1%，葡萄糖 0.4%，瓊脂1.5%，pH 7.2。

放線菌發酵培養基：葡萄糖0.5%，麥芽膏1%，棉籽餅粉1.0%，可溶性淀粉2%，酵母膏0.5%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀0.05%，氯化鈉0.1%，碳酸鈣 0.3%，pH 7.2。

1.4 提取與分離純化

發酵液用高速離心機5000 r/min離心10 min，得到菌絲體和上清液兩部分。上清液通過HP-20大孔吸附樹脂吸附后，分別用去離子水、30%甲醇、60%甲醇、100%甲醇梯度洗脫，濃縮后得到4部分浸膏。對100%甲醇洗脫部分進行正相硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇進行梯度洗脫，通過TLC檢測合并流份，共得4個流份（Fr.1～Fr.4）。流份Fr.2進一步進行正相硅膠柱分離純化，以二氯甲烷-丙酮梯度洗脫，得6個流份（Fr.2.1～Fr.2.6）。流份Fr.2.4通過反相半制備HPLC（乙腈-水，50：50，V/V）進行分離純化，得到化合物1（300 mg）和2（30 mg）。對30%甲醇洗脫部分進行Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇，50：50）等度洗脫，共得23個流份（Fr.30.1～Fr.30.23），對流份Fr.30-18通過反相半制備HPLC（甲醇-水，30：70）進行分離純化，得到化合物3（12 mg），對流份Fr.30.20通過反相半制備HPLC（乙腈-水，10：90）進行分離純化，得到化合物4（7 mg）。

1.5 化合物活性測試

1.5.1 抗甲型流感病毒活性測試

參照文獻報道的實驗方法[4]。293T-Gluc細胞接種于96孔板，每孔接種2.5×104個細胞，于100 μL含10%FBS的DMEM培養液37 ℃、5% CO2中培養。細胞接種24 h后每孔加入1 μL待測化合物，同時設置空白對照、陰性對照（DMSO）和陽性對照（利巴韋林）。化合物加入1 h后按照MOI=0.05進行病毒感染，繼續于37 ℃培養24 h后，每孔取10 μL細胞上清，于多功能酶標儀（Berthold Centro LB 960）檢測Gluc活性。

1.5.2 抗艾滋病毒活性測試

參照文獻報道的實驗方法[5]。以pNL-luc-E 0.6 μg和pHIT/G（VSV-G）0.4 μg共轉染293T細胞，48 h后收取上清，過0.45 μm的濾膜即得到pHIT/G（VSV-G）包被的HIV-1假病毒。通過ELISA（Biomerieux）試劑盒檢測病毒的感染復數（MOI）。SupT1細胞濃度為5.0×105個/mL，直接鋪96孔板，每孔200 μL，同時加入HIV-1假病毒（MOI=1）。加入待測樣品，同時設置空白對照、陽性對照（依法韋侖）和陰性對照（DMSO），37 ℃孵育48 h。取50 μL細胞懸液，加入2×Luciferase Cell Culture Lysis裂解液50 μL，37 ℃孵育0.5 h后，取其中6 μL細胞裂解液加入40 μL熒光素酶底物，利用Berthold Centro XS3 LB 960酶標儀測定熒光素酶值。

1.5.3 抗菌活性測試

根據美國臨床實驗室標準化委員會標準[6]，采用微稀釋法對分離得到的勃利霉素A（1）和F（2）進行體外抗菌活性測定：將測試菌從凍存管中以1：1000比例接種于LB液體培養基中，37 ℃生長6～8 h，濃度為109個/mL。再利用LB液體培養基進行梯度稀釋，制成濃度為105個/mL的菌懸液。在96孔板中，第1列和第12列加入LB培養基100 μL作為空白對照，第2列和第11列加入100 μL上述105個/mL測試菌液作為陰性對照。化合物用LB液體培養基二倍稀釋成各種所需濃度，分別加入96孔板，體系終體積為100 μL，化合物1的樣品終濃度分別為：128、64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL，化合物2的樣品終濃度分別為：64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL；生長6～8 h后無菌生長的孔板內所含化合物最小的濃度即為最低抑菌濃度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

1.5.4 抗結核分枝桿菌活性測試

根據美國臨床實驗室標準化委員會標準[6]，采用阿爾瑪藍（MABA）法測定化合物抗結核分枝桿菌活性。將測試菌株結核分枝桿菌H37Rv接種于含0.2%（V/V）甘油、0.05%吐溫80和10% OADC的7H9液體培養基中。待培養至對數生長期，經8 μm孔徑的濾膜過濾后，3000 r/min 離心10 min收集菌體并用新鮮的7H9培養基重懸。酶標儀測定菌在A570nm的吸收值，并計算菌濃度。在96孔黑壁透明底板中，化合物用7H9培養基（含10% ADC）二倍稀釋成各種所需濃度。每孔加入結核分枝桿菌100 μL，使其終濃度為5×105 CFU/mL。37 ℃孵育7 d，第七天每孔加入12.5 μL的20%吐溫80和20 μL Alamar blue。孵育24 h后，測定其MIC。

1.6 全基因組測序和生物合成基因簇分析

單一克隆的菌株CPCC 203679接種至100 mL TSB培養基中，28 ℃培養箱220 r/min震蕩72 h，培養完成后收集菌體，使用細菌DNA提取試劑盒提取基因組DNA。純化的基因組DNA通過NanoDrop 2000進行純度和質量測定，高質量的DNA用于建庫測序。

利用二代測序Illumina平臺，對質檢合格的DNA樣品構建插入片段為～400 bp的片段，進行PE150（pair-end）測序，單端測序讀長150 bp，每個樣品提供不低于基因組100×覆蓋深度的原始測序數據量（raw data），利用軟件SOAP denovo2對剪切后序列進行拼接[7]，最終組裝得到多條基因組scaffold。

利用Glimmer[8]，GeneMarkS[9]，Prodigal軟件對基因組中的編碼序列（CDS）進行預測；利用tRNAscan-SE v2.0[10]軟件對基因組中包含的tRNA進行預測；利用Barrnap軟件（https：//github.com/tseemann/barrnap）對基因組中包含的rRNA進行預測，使用Tandem Repeats Finder軟件[11]進行串聯重復序列預測；通過與NR（Non-Redundant Protein Sequence Database），Swiss-Prot[11]（Swiss-Prot Protein Sequence Database），Pfam[12]（protein families database），COG[13]（Clusters of Orthologous Groups of proteins）、GO（Gene Ontology），KEGG[14]（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等6大數據庫分別進行比對，獲得基因組中功能注釋信息?；蚪M內的次級代謝產物生物合成基因簇通過antiSMASH 7.1.0[15]比對得到。

2 實驗結果

2.1 化合物的結構鑒定

化合物1：淡黃色粉末。[α]25D -24.8 （c 0.2 CH3OH），ESI-MS m/z： 488.3 [M-H]–，分子式C28H43NO6。1H NMR （600 MHz， CDCl3）： δH 6.82 （1H， d， J=10.8 Hz， H-13）， 6.38 （1H， dd， J=16.2， 10.8 Hz， H-14）， 6.19 （1H， m， H-15）， 4.98 （1H， dt， J=11.4， 3.0 Hz， H-17）， 4.10 （1H， d， J=9.6 Hz， H-11）， 3.86 （1H， dt， J=10.2， 3.0 Hz， H-3）， 2.71 （1H， m， H-18）， 2.58 （1H， m， H-16a）， 2.55 （1H， m， H-16b）， 2.49 （2H， m， H-19）， 2.40 （1H， dd， J=16.8， 11.2 Hz， H-2a）， 2.31 （1H， dd， J=16.8， 2.4 Hz， H-2b）， 2.01 （1H， m， H-20a）， 1.96 （1H， m， H-20a）， 1.88 （1H， m， H-20b）， 1.86 （1H， m， H-10）， 1.80 （2H， m， H-21）， 1.67 （1H， m， H-4）， 1.61 （1H， m， H-6）， 1.56 （1H， m， H-8）， 1.36 （1H， m， H-22b）， 1.20 （1H， m， H-4a）， 1.10 （1H， m， H-7a）， 1.05 （1H， m， H-9a）， 1.05 （3H， d， J=6.0 Hz， H-27）， 0.96 （1H， m， H-7b）， 0.93 （1H， m， H-5b）， 0.83 （3H， d， J=6.0 Hz， H-26）， 0.82 （3H， d， J=7.2 Hz， H-25）， 0.79 （3H， d， J=6.0 Hz， H-24）. 0.72 （1H， m， H-9b）; 13C NMR （150 MHz， CDCl3）： δC 179.7 （COOH）， 172.2 （C-1）， 144.0 （C-13）， 138.4 （C-15）， 126.9 （C-14）， 118.2 （CN）， 115.9 （C-12）， 76.4 （C-17）， 73.1 （C-11）， 69.9 （C-3）， 48.3 （C-18）， 47.8 （C-19）， 45.8 （C-7）， 42.9 （C-5）， 39.1 （C-2）， 37.4 （C-9）， 35.9 （C-16）， 35.5 （C-4）， 35.2 （C-10）， 31.2 （C-20）， 29.6 （C-22）， 27.0 （C-8）， 26.2 （C-6）， 25.2 （C-21）， 20.2 （C-26）， 18.2 （C-24）， 16.9 （C-25）， 14.9 （C-27）。以上數據與文獻[16]報道的數據一致。故鑒定該化合物為勃利霉素A。

化合物2：淡黃色粉末。[α]25D +13.5 （c 0.2 CH3OH），ESI-MS m/z： 488.3 [M–H]–，分子式為C28H43NO6。1H NMR （600 MHz， CDCl3）： δH 6.62 （1H， d， J=10.8 Hz， H-13）， 6.54 （1H， dd， J=15.0， 10.8 Hz， H-14）， 5.99 （1H， m， H-15）， 5.15 （1H， dt， J=9.0， 3.0 Hz， H-17）， 3.90 （1H， ddd， J=9.6， 2.4， 2.4 Hz， H-3）， 3.81 （1H， d， J=

7.8 Hz， H-11）， 2.66 （1H， m， H-16a）， 2.57 （1H， m， H-18）， 2.57 （2H， m， H-22）， 2.42 （1H， m， H-16b）， 1.92 （1H， m， H-19a）， 1.38 （1H， m， H-19b）， 2.32 （1H， dd， J=16.8， 2.4 Hz， H-9a）， 2.28 （1H， dd， J=16.8， 9.6 Hz， H-9b）， 1.92 （1H， m， H-19a）， 1.92 （2H， m， H-21）， 1.86 （1H， m， H-10）， 1.86 （1H， m， H-4）， 1.76 （1H， m， H-20a）， 1.71 （1H， m， H-6）， 1.86 （1H， m， H-4）， 1.61 （1H， m， H-8）， 1.38 （1H， m， H-19b），1.13 （1H， m， H-7a）， 1.02 （3H， d， J=6.6 Hz， H-27）， 0.97（1H， m， H-7b）， 0.96 （1H， m， H-5b）， 0.84 （3H， d， J=6.6 Hz， H-26）， 0.82 （3H， d， J=7.2 Hz， H-24） ， 0.80 （3H， d， J=6.0 Hz， H-25）; 13C NMR

（150 MHz， CDCl3）： δC 180.1（COOH）， 173.4 （C-1）， 144.2 （C-13）， 139.1 （C-15）， 129.2 （C-14）， 116.0 （CN）， 115.0 （C-12）， 79.4 （C-17）， 75.5 （C-11）， 71.1 （C-3）， 48.2 （C-18）， 48.1 （C-19）， 47.0 （C-22）， 42.8 （C-5）， 37.8 （C-16）， 37.3 （C-2）， 37.2 （C-9）， 35.6 （C-10）， 34.6 （C-4）， 31.2 （C-21）， 29.8 （C-19）， 26.7 （C-6）， 26.1 （C-8）， 25.5 （C-20）， 20.0 （C-26）， 18.2 （C-25）， 17.6 （C-24）， 15.6 （C-27）。以上數據與文獻[17]報道的數據一致。故鑒定該化合物為勃利霉素F。

化合物3：白色粉末。[α]25D –32.1 （c 0.1 CH3OH），ESI-MS m/z： 297.2 [M–H]–，分子式為C11H14N4O4S。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6）： δH 12.39 （1H， br s， 4-OH）， 8.32 （1H， s， H-8）， 8.07 （1H， s， H-2）， 5.86 （1H， d， J=6.0 Hz， H-1?）， 5.53 （1H， d， J=6.6 Hz， 2?-OH）， 5.34 （1H， d， J=4.8 Hz， 3?-OH）， 4.62 （1H， dd， J=11.4， 5.4 Hz， H-2?）， 4.09 （1H， dd， J=9.6， 4.8 Hz， H-3?）， 4.02 （1H， m， H-4?）， 2.85 （1H， dd， J=14.4， 6.0 Hz， Ha-5?）， 2.76 （1H， dd， J=14.4， 7.2 Hz， Hb-5?）， 2.05 （3H， s， -SCH3）; 13C NMR （150 MHz， DMSO-d6）： δC 156.5 （C-4）， 148.4 （C-6）， 145.9 （C-2）， 139.0 （C-8）， 124.5 （C-5）， 87.3 （C-1?）， 83.9 （C-4?）， 73.1 （C-2?）， 72.5 （C-3?）， 36.0 （C-5?）， 15.6 （-SCH3）。以上數據與文獻[18]報道的數據一致。故鑒定該化合物為5?-脫氧-5?-甲硫肌苷。

化合物4：白色粉末。[α]25D –22.6 （c 0.1 CH3OH），ESI-MS m/z： 185.2 [M+H]+，分子式為C9H16N2O2。1H NMR （600 MHz， DMSO-d6）： δH 8.10 （1H， br s， -NH）， 7.96 （1H， br s， -NH）， 3.89 （1H， q， J=6.0 Hz，

H-2）， 3.74 （1H， m， H-2?）， 1.85 （1H， m， H-3?）， 1.40 （H， m， Ha-4?）， 1.27 （3H， d， J=6.0 Hz， H-3）， 1.18 （H， m， Hb-4?）， 0.91 （3H， d， J=6.0 Hz， H-6?）， 0.85 （3H， t， J=6.0 Hz， H-5?）; 13C NMR （150 MHz， DMSO-d6）： δC 168.5 （C-1）， 166.6 （C-1?）， 58.2 （C-2?）， 49.6 （C-2）， 38.0 （C-3?）， 24.1 （C-4?）， 19.8 （C-3）， 15.0 （C-6?）， 11.9 （C-5?）。以上數據與文獻[19]報道的數據一致。故鑒定該化合物為環（L-丙氨酸-L-異亮氨酸）二肽。

2.2 活性結果

對本實驗分離得到的化合物1和2分別進行了抗甲型流感病毒、抗艾滋病毒、抗耐藥菌、抗結核分枝桿菌活性測試。結果顯示，化合物1和2顯示良好的抗甲型流感病毒活性，其IC50值分別為2.40和4.67 μmol/L（CC50值均大于100 μmol/L），強于陽性對照藥利巴韋林（IC50=20.5 μmol/L）；化合物1和2具有一定的抗艾滋病毒活性，其IC50值分別為14.9和15.8 μmol/L（CC50值均大于100 μmol/L）；化合物1對多株革蘭陽性耐藥菌均顯示良好的抑制活性（表1），化合物2未顯示明顯的抗耐藥菌活性；化合物1具有良好的抗結核分枝桿菌活性，其MIC值為7.8 μg/mL，化合物2未顯示抗結核分枝桿菌活性（MICgt;32 μg/mL）。

2.3 菌株基因組特征及次級代謝產物生物合成基因簇分析

菌株CPCC 203679基因組大小為8，055，535 bp，平均（G+C）含量為72.58%，含有7507個基因。編碼基因序列總長度7，021，527 bp，占DNA全長87.16%。在7507個基因中，長度在101～1000 bp的基因有4826個，長度大于1000 bp的基因有2681個。此外，基因組還檢測到了3個rRNA基因和74個tRNA基因（表2）。經antiSMASH軟件預測分析其基因組序列，發現該菌株可能含有44個生物合成基因簇（表3），包括14個聚酮類、1個聚酮-非核糖體肽、7個萜烯類、6個非核糖體肽、4個羊毛硫肽、3個鐵載體、2個吲哚、2個核糖體肽、1個呋喃、1個依克托因、1個黑色素、1個氰化氫和1個丁內酯。其中，14個基因簇與sapB、5-dimethylallylindole-3-acetonitrile、desferrioxamin B、flaviolin、霍烯、7-prenylisatin、isorenieratene、coelichelin、streptothricin、albaflacenone、抗霉素、土臭味素、ectoine和tetrafibricin具有高度相似性（gt;70%）。10個基因簇顯示中等程度的相似性（30%～70%的基因顯示相似性），與catenulipeptin、informatipeptin、candicidin、spore pigment、isorenietatene、streptovaricin、fluostatins、lipeptide、nigericin、piericidin A1和linearmycin A的生物合成基因簇相似。這些中高相似性基因簇的存在預示著菌株CPCC 203679具有生產這些抗生素或其類似物的可能性。16個基因簇與已報道的methylenomycin A、pristinin A3、kinamycin、lysolipin I、paulomycin、steptovaricin、istamycin、aborycin、alanylclavam、ebelactone、lipopeptide 8D1-1、maduramicin、candicidin、cadaside A、lactonamycin以及cyphomycin的生物合成基因簇具有較低的相似性（lt;30%）。另外，還有5個基因簇相對于任何已知的簇都不具有相似性。這些隱型次級代謝生物合成基因簇的存在預示著菌株CPCC 203679可以產生新型次級代謝產物的潛力。

3 討論與結論

本文從一株鏈霉菌CPCC 203679發酵液中分離得到了4個化合物，包括2個大環內酯（1和2）、1個核苷（3）、1個環二肽（4）?；衔?和2為勃利霉素類化合物，藥理活性顯示了良好的甲型流感病毒活性，尤其是化合物1的IC50值為陽性藥的8.5倍，為尋找具有抗甲型流感病毒活性的抗生素奠定了一定的基礎。同時，化合物1還具有良好的抗耐藥菌和抗結核分枝桿菌活性。文獻報道勃利霉素類化合物具有抗腫瘤活性[20-21]、血管生成抑制活性[22]、抗瘧疾活性[23-24]、抗植物病原菌活性[25-26]?；衔?為環二肽類化合物，廣泛分布于植物和微生物中，該類化合物大多具有生物活性，包括抗菌、細胞毒活性和增強免疫力等[27]。本研究還獲得了鏈霉菌CPCC 203679的全基因組序列，并利用antiSMASH（7.1.0）在線工具預測了該菌株潛在的生物合成基因簇，發現了44條生物合成基因簇，包含21條低相似度或無相似性的基因簇，預示著它們可能編碼新結構的次級代謝產物。同時，還發現菌株CPCC 203679中存在很多在目前發酵條件下依然沉默的生物合成基因簇。在下一步研究中，可以結合OSMAC策略、調控基因的過表達生物合成基因簇異源表等多種手段激沉默的生物合成基因簇，對該菌株中的代謝產物進行深入挖掘。綜上所述，鏈霉菌CPCC 203679具有進一步研究的價值，有可能發現更多的結構多樣化的活性次級代謝產物。

參 考 文 獻

Jakubiec-Krzesniak K， Rajnisz-Mateusiak A， Guspiel A， et al. Secondary metabolites of actinomycetes and their antibacterial， antifungal and antiviral properties[J]. Pol J Microbiol， 2018， 67（3）： 259-272.

Procópio R E， Silva I R， Martins M K， et al. Antibiotics produced by Streptomyces[J]. Braz J Infect Dis， 2012， 16（5）： 466-471.

Liu T， Ren Z， Chunyu W X， et al. Exploration of diverse secondary metabolites from Streptomyces sp. YINM00001， using genome mining and one strain many compounds approach[J]. Front Microbiol， 2022， 13： 831174.

Gao Q， Wang Z， Liu Z， et al. A cell-based high-throughput approach to identify inhibitors of influenza A virus[J]. Acta Pharm Sin B， 2014， 4（4）： 301-306.

Ding J， Zhao J， Yang， Z， et al. Microbial natural product alternatiol 5-O-methyl ether inhibits HIV-1 integration by blocking nuclear import of the pre-integration complex[J]. Viruses， 2017， 9： 105.

Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; twenty-sixth informational supplement， CLSI document M100-S26， clinical and laboratory standards institute[S]， Wayne， PA， 2016.

Luo R， Liu B， Xie Y， et al. SOAPdenovo2： An empirically improved memory-efficient short-read de novo assembler[J]. Gigascience， 2012， 1（1）： 18.

Delcher A L， Bratke K A， Powers E C， et al. Identifying bacterial genes and endosymbiont DNA with GLIMMER[J]. Bioinformatics， 2007， 23（6）： 673-679.

Besemer J， Borodovsky M. GeneMark： Web software for gene finding in prokaryotes， eukaryotes and viruses[J]. Nucleic Acids Res， 2005， 33： W451-W454.

Chan P P， Lowe T M. tRNAscan-SE： Searching for tRNA genes in genomic sequences[J]. Methods Mol Biol， 2019， 1962： 1-14.

Bairoch A， Apweiler R. The SWISS-PROT protein sequence database and its supplement TrEMBL in 2000[J]. Nucleic Acids Res， 2000， 28（1）： 45-48.

Finn R D， Bateman A， Clements J， et al. Pfam： The protein families database[J]. Nucleic Acids Res， 2014， 42： 222-230.

Jensen L J， Julien P， Kuhn M， et al. EggNOG： Automated construction and annotation of orthologous groups of genes[J]. Nucleic Acids Res， 2008， 36： D250-D254.

Kanehisa M， Goto S. KEGG： Kyoto encyclopedia of genes and genomes[J]. Nucleic Acids Res， 2000， 28（1）： 27-30.

Blin K， Shaw S， Augustijn H E， et al. AntiSMASH 7.0： New and improved predictions for detection， regulation， chemical structures and visualisation[J]. Nucleic Acids Res， 2023， 51（W1）： W46-W50.

Hamed A， Abdel-Razek A S， Frese M， et al. N-Acetylborrelidin B： A new bioactive metabolite from Streptomyces mutabilis sp. MII[J]. Zeitschrift für Naturforschung C， 2018， 73（1-2）： 49-57.

Yu M， Li Y， Banakar S P， et al. New metabolites from the co-culture of marine-derived actinomycete Streptomyces rochei MB037 and fungus rhinocladiella similis 35[J]. Front Microbiol， 2019， 10： 915.

陳明華， 巫曄翔， 董飚， 等. 鏈霉菌CPCC 202950的化學成分研究[J]. 中國中藥雜志， 2015， 40（7）： 1320-1324.

Ding Z G， Zhao J Y， Wang P W， et al. 1H and 13C NMR assignments of eight nitrogen containing compounds from Nocardia alba sp.nov （YIM 30243T）[J]. Magn Reson Chem， 2009， 47： 366-370.

周明， 胡亮， 余聶芳. 新型血管生成抑制劑Borrelidin抗腫瘤作用及其合成的研究進展[J]. 腫瘤藥學， 2013， 3（2）： 82-86.

Habibi D， Ogloff N， Jalili R B， et al. Borrelidin， a small molecule nitrile-containing macrolide inhibitor of threonyl-tRNA synthetase， is a potent inducer of apoptosis in acute lymphoblastic leukemia[J]. Invest New Drugs， 2012， 30（4）： 1361-1370.

Wakabayashi T， Kageyama R， Naruse N， et al. Borrelidin is an angiogenesis inhibitor; disruption of angiogenic capillary vessels in a rat aorta matrix culture model[J]. J Antibiot， 1997， 50（8）： 671-676.

Otoguro K， Ui H， Ishiyama A， et al. In vitro and in vivo antimalarial activities of a non-glycosidic 18-membered macrolide antibiotic， borrelidin， against drug-resistant strains of Plasmodia[J]. J Antibiot， 2003， 56（8）： 727-729.

Ishiyama A， Iwatsuki M， Namatame M， et al. Borrelidin， a potent antimalarial： Stage-specific inhibition profile of synchronized cultures of Plasmodium falciparum[J]. J Antibiot， 2011， 64（5）： 381-384.

王亮. 勃利霉素的抗菌活性研究[D]. 哈爾濱： 東北農業大學， "2013.

白曙光. 勃利霉素對馬鈴薯晚疫蘇氨酰-tRNA合成酶的作用[D]. 哈爾濱： 東北農業大學， 2012．

鄭婷莉， 朱柯， 石光豐， 等. 環二肽生物活性的研究進展[J]. 中國抗生素雜志， 2024， 49（1）： 1-12.