基于菌群拮抗原理治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染的實驗研究

摘要：目的 探究銅綠假單胞菌拮抗多重耐藥肺炎克雷伯菌的作用及其機制，以期為臨床治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染提供實驗依據。方法 收集本院臨床分離的4株銅綠假單胞菌（PA）和1株多重耐藥肺炎克雷伯菌（MDR-KP8），建立兩種菌共培養模型和平板互作模型，觀察兩者間的互作關系；收集菌株上清液，鹽酸-氯仿、硫酸-蒽酮法對綠膿素和鼠李糖脂進行初步提取和定量，探究PA與MDR-KP8共培養的變化；硅膠吸附法和高效液相色譜法對綠膿素進行純化和定量，肉湯稀釋法測定綠膿素對MDR-KP8的最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC），評價綠膿素的抗菌活性；堿性磷酸酶試劑盒、傅里葉紅外光譜（FTIR）法探究綠膿素對MDR-KP8作用機理。結果 共培養4 d，4株PA菌落數均多于MDR-KP8菌落數；平板互作實驗顯示隨著4株PA與MDR-KP8距離的增加，MDR-KP8菌落面積也在增加，而PA菌落面積未發生明顯變化；定量結果顯示4株PA共培養分泌的綠膿素和鼠李糖脂含量均多于單獨培養時的含量。綠膿素對MDR-KP8最小抑菌濃度為128 μg/mL；經綠膿素處理后，上清液中堿性磷酸酶、核酸、蛋白質等物質含量增加，蛋白質的二級結構發生變化。結論 PA與MDR-KP8間存在拮抗關系，PA分泌的綠膿素通過破壞細菌細胞壁，破壞蛋白質的二級結構，從而抑制MDR-KP8的生長繁殖。

關鍵詞：多重耐藥肺炎克雷伯菌；銅綠假單胞菌；拮抗作用；綠膿素；細胞膜

中圖分類號：R965.1 文獻標志碼：A

Experimental study on the treatment of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae infection based on the principle of microbiota antagonism

Chen Yan1，2， Deng Liying3， Wei Yingying1， Dai Peiru1， Wu Xiaomei1， Hu Wen4， and Chen Chunlin1

（1 Yichun College， School of Chemistry and Biological Engineering， Yichun 336000; 2 Shanghai Pudong Huamu Community Health Service Center， Shanghai 201204; 3 Yichun College of Medicine， Yichun 336000; 4 Yichun City People's Hospital， Yichun 336000）

Abstract Objective To explore the effect and mechanism of Pseudomonas aeruginosa in antagonizing multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae in order to provide an experimental basis for the clinical treatment of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae infection. Methods Four strains of Pseudomonas aeruginosa （PA） and one strain of multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae （MDR-KP8） were collected from our hospital， the co-culture model and plate interaction model of the two strains were established， and the interaction between the two strains was observed. The supernatant of the strain was collected， the pyocyanin and rhamnolipid were preliminary extracted and quantified by the hydrochloric acid-chloroform and sulfate-anthone methods， and the changes of PA and MDR-KP8 co-culture were explored. The silica gel adsorption method and high-performance liquid chromatography were used to purify and quantify pyocyanin， the minimum inhibitory concentration （MIC） and minimum bactericidal concentration （MBC） of pyocyanin against MDR-KP8 were determined by the broth dilution method， and the antibacterial activity of pyocyanin was evaluated. Alkaline phosphatase kit and Fourier transform infrared spectroscopy （FTIR） were used to explore the mechanism of action of pyocyanin on MDR-KP8. Results The results showed that the number of colonies in the four PA strains was higher than that of MDR-KP8 after 4 days. Plate interaction experiments showed that as the increase of the distance between the four PA strains and MDR-KP8 grew， so did the colony area of MDR-KP8. However， the colony area of PA did not change significantly. The quantitative results showed that the contents of pyocyanin and rhamnolipid secreted by the four PA co-cultures were higher than those in the separate culture. The minimum inhibitory concentration of pyocyanin against MDR-KP8 was 128 μg/mL; After treatment with pyocyanin， the content of alkaline phosphatase， nucleic acid， protein and other substances in the supernatant increased， and the secondary structure of protein changed. Conclusion There was an antagonistic relationship between PA and MDR-KP8， and the pyocyanin secreted by PA inhibited the growth and reproduction of MDR-KP8 by destroying the bacterial cell wall and the secondary structure of the protein.

Key words Multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae; Pseudomonas aeruginosa; Antagonism; Pyocyanin; Cell membrane

肺炎克雷伯菌作為臨床常見的革蘭陰性致病菌，可引起呼吸道、泌尿道感染等多部位感染，是導致危重癥患者死亡的重要原因之一[1]。碳青霉烯類藥物是目前臨床上治療肺炎克雷伯菌的最后一道防線。由于近年來抗生素的不合理運用，耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌（CRKP）檢出率再次攀升。2024年中國耐藥網監測顯示，236510株菌株中檢出率排名前5的分別是大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌和鮑曼不動桿菌。其中肺炎克雷伯菌對亞胺培南和美羅培南的耐藥率從2022年的22.6%和24.2%上升至2024年的25.5%和26.4%[2]。CRKP在表現出對碳青霉烯類藥物的高水平耐藥的同時，對其他多類抗菌藥物也表現出多重耐藥甚至泛耐藥[3]。多重耐藥肺炎克雷伯菌抗感染治療已成為臨床的一大難題。

臨床實驗報道，利用菌群拮抗原理改變用藥方案48 h后，痰培養未顯示出多重耐藥肺炎克雷伯菌生長[4-5]。菌群拮抗原理治療多重耐藥菌可能是一種新的治療策略。本實驗基于前期臨床觀察，發現銅綠假單胞菌（PA）與肺炎克雷伯菌（KP）混合感染時，PA的定植量與KP的定植量隨時間不斷變化，兩者間可能存在拮抗關系，尚需通過實驗進行驗證。因此，實驗以PA和KP為研究對象，探究兩者間的互作關系與機理，以期為闡述PA與KP間的拮抗關系提供實驗依據與理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源

1株多重耐藥肺炎克雷伯菌（multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae）MDR-KP8，4株銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PA3、PA6、PA39、PA71，分別來自于宜春市人民醫院2022年呼吸科患者痰液。

1.1.2 培養基及試劑

水解酪蛋白（M-H）瓊脂，由各試劑配制而成：可溶性淀粉（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號200114）、酸水解酪蛋白（北京索萊寶生物科技有限公司，批號10290033）、牛肉膏（北京索萊寶生物科技有限公司，批號414Z051）、瓊脂粉（北京索萊寶生物科技有限公司，批號507Z021））；綠膿素，美國GLPBIO公司，批號GC13137，純度≥98%；堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（萬類生物有限公司）。

1.1.3 儀器

TECAN Infinite 200 PRO全波段酶標儀（北京世貿遠東科學儀器有限公司）；福立高效液相儀（FL2200）（浙江福利分析儀器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 微量稀釋法藥敏實驗

采用微量肉湯稀釋法測定哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、阿米卡星和亞胺培南等8種抗生素對4株PA及1株KP的最小抑菌濃度（MIC），參照美國臨床和實驗室標準化協會（Clinical and Laboratory Standards Institute， CLSI）2017年M100s-27th推薦的規范和折點實施試驗和判讀結果[6]。

1.2.2 PA與MDR-KP8共培養模型建立與生長情況定量

參考祝司霞和Zhao等[7-8]方法并加以改進。配制濃度為1×106 CFU/mL的菌懸液，MDR-KP8菌液和PA菌液的比例為1：1。于24孔細胞培養板內建立4組共培養模型，分別為MDR-KP8與PA3、MDR-KP8與PA6、MDR-KP8與PA39、MDR-KP8與PA71混合培養。37 ℃下恒溫培養。于共培養的第1、2、3和4天取一定量的菌液利用平板稀釋法對4組混合菌液內的PA和MDR-KP8菌落數進行定量。

1.2.3 PA與MDR-KP8平板相互作用模型的建立

參考袁陽等方法[9]。于MH瓊脂板上進行梯度間距培養。即同一種菌種間的間距為0.5 cm，不同菌株間距成等差數列。每個平板上設置8個梯度，每個點的接菌量均為1.5 μL，將平板置于37 ℃培養2 d。

1.2.4 PA與MDR-KP8上清液的制備及活性測試

MDR-KP8和PA上清液的提取。參考Alghofaili 等[10]方法，將收集的5株菌分離培養72 h后，于

4 ℃、8000 r/min離心10 min，0.22 μm濾菌器過濾，制備好上清液備用。進一步測試PA上清液對MDR-KP8和MDR-KP8上清液對PA生長的影響。配制5株菌菌懸液。設置實驗組和對照組，吸取100 μL菌液于96孔細胞培養板內，添加制備好的MDR-KP8上清液和PA上清液100 μL 或同等體積生理鹽水于對照組中。充分混勻，37 ℃培養16～24 h于酶標儀A600測其活性。

1.2.5 MDR-KP8對PA分泌綠膿素及鼠李糖脂的影響

設置4株PA單獨培養組、4株混合培養組（4株PA分別與MDR-KP8混合培養）。96 h后，鹽酸-氯仿萃取法提取上述8組菌株分泌的綠膿素，取氯仿層旋蒸得粗品，520 nm處測定其吸光度[11]。進一步將菌液6000 r/min離心20 min取上清，于80 ℃中水浴加熱

15 min，8000 r/min離心15 min，HCL調節pH為2，上清液于4 ℃下保存8 h，8000 r/min離心10 min，將沉淀溶解于甲醇中，離心收集有機相，真空冷凍干燥得鼠李糖脂粗提物。硫酸-蒽酮法測定8組菌株分泌的鼠李糖脂含量[12]。

1.2.6 綠膿素及鼠李糖脂粗提物抗菌活性的測定及純化

收集4株PA與MDR-KP8混合培養后產生的綠膿素及鼠李糖脂粗提物，利用牛津杯法測定綠膿素及鼠李糖脂粗提物對MDR-KP8的抗菌活性。判定標準為：抑菌圈直徑lt;10 mm判定為耐藥和無抑菌作用；等于10 mm判定為輕度敏感；11～15 mm判定為中度敏感；≥16 mm判定為高度敏感[13] 。依據判定標準發現綠膿素粗提物對MDR-KP8高度敏感，鼠李糖脂粗提物為耐藥。進一步對4株PA與MDR-KP8混合培養后產生的綠膿素粗提物進行純化。采用硅膠吸附法，氯仿-甲醇（30：1）進行梯度洗脫，薄層色譜檢測分析合并得到樣品。質譜及高效液相色譜法進行定量[14]。

高效液相色譜條件為：甲醇為B相；水（1%甲酸）為A相。梯度洗脫程序：0～6 min，10%B，90%A；6～15 min，12%B，88%A；平衡10 min；進樣量為

15 μL；柱溫30 ℃。質譜條件為：電噴霧離子源正離子模式，霧化氣溫度320 ℃，霧化氣流速8 L/min，毛細管電壓3500 V，掃描范圍50～1000 m/z，碰撞能量20 eV。

1.2.7 綠膿素MIC和MBC測定

取配置好的MDR-KP8菌懸液100 μL，加入96孔板中，再加入100 μL不同濃度純化后的綠膿素。使綠膿素終濃度分別為512、256、128、64、32、16、8和4 μg/mL。以僅加培養基的孔為培養基對照組，僅加菌懸液的孔作為菌液對照組，37 ℃恒溫培養箱中培養24 h后于600 nm處測定吸光值。從肉眼可見無菌體生長的孔中取10 μL菌液涂布于LB固體瓊脂培養基上，37 ℃培養過夜，將平板上無菌落生長的最低濃度作為最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.8 MDR-KP8對PA分泌綠膿素及鼠李糖脂的影響

采用ALP試劑盒測定ALP活力。在液體培養基中加入濃度為108 CFU/mL的MDR-KP8菌懸液和終質量濃度分別為0（對照）、1/2 MIC、1×MIC、2×MIC綠膿素溶液，放置于搖床中（150 r/min、37 ℃）培養。于0、3、6、9、12 h各取2 mL培養液8000 r/min離心

10 min，進一步用ALP試劑盒測定上清液中ALP的活力。

1.2.9 綠膿素對MDR-KP8蛋白質和核酸的影響

方法同“1.2.8”，取各時間段的培養液離心。取上清液測定其在260 nm和280 nm處的吸光度值（A260和A280），以無菌肉湯作為對照組，每次設置3個平行。

1.2.10 綠膿素對MDR-KP8細菌分子結構的影響

采用傅里葉變換紅外光譜法（FTIR）對MDR-KP8分子結構變化進行分析[15]。在細菌培養液中加入不同濃度的綠膿素，使其終濃度為1/2 MIC、1×MIC、2×MIC綠膿素。搖床中以37 ℃、150 r/min培養12 h后，取3 mL菌液以8000 r/min離心10 min，去上清液，用PBS清洗細胞兩次，冷凍干燥，用FTIR儀對干燥的細菌細胞進行分析。

1.2.11 數據分析

所有數據采用（x±s）表示，采用SPSS21.0統計學分析中one-way ANOVA，通過t檢驗進行差異顯著性分析，當P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 5株菌藥敏結果

4株PA及1株MDR-KP8對8個抗生素的藥敏結果見表1，PA71僅對磷霉素耐藥，其它抗生素均為敏感。PA3和PA6僅對頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉及亞胺培南敏感，PA39僅對頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉敏感，其余均為耐藥。MDR-KP8對8個抗生素均表現為耐藥。

2.2 PA與MDR-KP8共培期間菌落數定量

從生長趨勢上看（圖1），共培養4 d后，PA3、PA6、PA39、PA71和MDR-KP8都呈下降趨勢，表明細菌進入衰亡期。其中圖1a和b中，MDR-KP8在共培養后的第3天、第4天下降最明顯。從菌落數上看，PA菌落數整體上都多于MDR-KP8菌落數，處于生長優勢地位，見圖1。

2.3 PA與MDR-KP8平板互作關系研究

培養2 d后，與遠端菌落相比，4株PA顯著抑制了近端MDR-KP8的生長。相反，MDR-KP8的接近度對4株PA的生長無明顯影響，見圖2。

2.4 PA與MDR-KP8上清液的活性

圖3a為多重耐藥肺炎克雷伯菌（MDR-KP8）與4株銅綠假單胞菌（PA3、PA6、PA39和PA71）上清液共培養生長情況，與MDR-KP8組生長情況對比可看出，共培養組MDR-KP8生長速度放緩。4株PA上清液對MDR-KP8生長呈現不同程度的抑制作用

（P＜0.0001））。圖3b中，PA與MDR-KP8上清液共培養組與4組PA單獨培養組對比說明，MDR-KP8上清液對4株PA生長無顯著影響。

2.5 MDR-KP8對PA分泌綠膿素及鼠李糖脂的影響

當PA遭受到外界壓力時，受群感效應調控會分泌綠膿素鼠李糖脂等多種物質來適應環境的變

化[16-17]。圖4顯示了PA在單獨培養和與MDR-KP8共培養時，分泌鼠李糖脂和綠膿素含量變化。4株PA與MDR-KP8混合培養后與單獨培養相比，分泌的鼠李糖脂含量顯著增加，具有顯著性差異（P＜0.0001）。PA3、PA71、PA39與MDR-KP8混合培養后與單獨培養組相比，綠膿素含量明顯增加，而PA6與MDR-KP8混合培養后與單獨培養組相比，綠膿素含量變化不明顯。

2.6 綠膿素的純化和定性

本研究PA菌株提取的綠膿素純化后，利用質譜、高效液相色譜進行定性和定量。由圖5a可知，二級質譜分子量為211.079，占比為100%。實驗結果與前人報道一致[18-19]。圖6c中純化物色譜峰保留時間為6.70 min，圖6b中綠膿素標準品色譜峰保留時間為6.65 min。推測該物質為綠膿素。利用標準曲線法求純化綠膿素濃度。制作標準曲線：Y=39023X+ 17464，r2=0.9992，X為物質濃度（μg/mL），Y為峰面積（mAU），通過計算濃度為17.32 μg/mL。

2.7 綠膿素MIC和MBC

綠膿素對MDR-KP8最小抑菌濃度和最小殺菌濃度測定結果見表2，最小抑菌濃度為128 μg/mL，最小殺菌濃度為256 μg/mL，具有較好的抑菌效果。研究與Abdelaziz等[14]報道相一致，綠膿素有良好的抗菌生物活性。

2.8 綠膿素對MDR-KP8堿性磷酸酶（ALP）的影響

ALP是一種位于細胞壁和細胞膜之間的磷酸單酯酶，菌懸液中ALP含量可反映細菌細胞壁完整性[20]。

與空白對照組相比，經綠膿素處理后，ALP的濃度增加，且隨著綠膿素濃度的增加，ALP濃度也在增加，見圖6。表明經綠膿素處理后，MDR-KP8細胞壁通透性改變，使得ALP從菌體內流出，細胞壁完整性受到破壞。細菌細胞壁具有固定的細胞形狀，使細胞具有一定的機械強度以抵抗低滲環境等其他外力對細胞損害的作用。細菌失去細胞壁的保護，難以生存[21]。

2.9 綠膿素對MDR-KP8蛋白質和核酸的影響

綠膿素與MDR-KP8共孵0～9 h后，上清液吸光度值（A260）先不斷增大，6～9 h時增速放緩，至12 h時增至最大。A280吸光度值在前3個小時增長較快，3～6 h進入遲緩期，6～12 h一直持續增大，見圖7a和b。核酸和蛋白質為大分子物質，于A260和A280處有強吸收峰。與對照組相比，吸光度A280和A260在0～12 h內不斷增大，說明上清液內的核酸和蛋白質大分子物質在不斷增加。在正常情況下蛋白質、核酸類大分子物質被細胞膜阻隔在細胞內，不會泄漏至細胞外，表明細胞膜通透性增大或細胞膜被破壞。

2.10 綠膿素對MDR-KP8細菌分子結構的影響

FT-IR被廣泛運用于細菌細胞膜表面有機官能基團的檢測[22]。圖8a為綠膿素處理前后MDR-KP8的紅外光圖譜。從原始圖譜中無法辨別出峰位變化。進一步對圖譜做去卷積和二階倒數處理[23]。

紅外光譜中，蛋白類物質酰胺Ⅰ區（1700～

1600 cm-1）常被用于分析蛋白質的二級結構變化。圖13b是綠膿素處理前后MDR-KP8在1700～1600 cm-1下的二階導數圖譜。其中，1682 cm-1和1674 cm-1兩處峰代表β轉角，1660 cm-1處峰代表無規轉曲，

1644 cm-1的峰代表α螺旋，1638 cm-1和1630 cm-1的峰代表β折疊[23]。由圖可知，經綠膿素處理后，MDR-KP8蛋白質結構發生變化。其中α螺旋（1644 cm-1）、無規則卷曲（1660 cm-1）、β轉角（1682 cm-1）變化比較明顯，峰面積也在減少；圖8c中，經綠膿素處理前后，1872、2919和2957 cm-1 3處波峰改變，這3處吸收峰分別代表著CH3對稱伸縮振動、CH2反對稱伸縮振動以及CH3反對稱伸縮振動，反映了細胞膜的變化；圖8d中，1120和1220 cm-1兩處發生變化，分別代表著核酸骨架中的P=O反對稱伸縮振動和C-C反對稱伸縮振動，主要反映MDR-KP8細胞核物質結構的變化，說明經綠膿素處理后，MDR-KP8細胞膜破裂，導致胞內的核酸物質遭到一定程度的損壞。

圖9為綠膿素處理前后多重耐藥肺炎克雷伯菌（MDR-KP8）酰胺I帶曲線擬合圖譜，對比可看出綠膿素處理前后蛋白質的吸收光不同，發生了波數的變化和波峰的偏移，說明MDR-KP8的二級結構發生了相應的變化[24]。

3 討論

多重耐藥肺炎克雷伯菌由于其高檢出率和高耐藥性，導致患者治療周期長、死亡率高、預后差[25]。

一項CRKP感染及死亡率的系統評價與薈萃分析報告指出，2462位感染KP的患者中，感染CRKP患者的死亡率幾乎為感染對碳青霉烯類敏感KP死亡率的2倍（42.14% vs 21.16%）。其中重癥監護室感染CRKP死亡率為48.9%，腎移植患者死亡率為43.13%[26-28]。研究指出產生碳青霉烯酶是導致肺炎克雷伯菌多重耐藥或泛耐藥的主要原因之一。碳青霉烯酶可降解多種抗生素，根據分子結構可分為A、B、D 3類酶，其中A類酶中KPC2～KPC13為最常見的碳青霉烯酶[29]。目前臨床上治療多重耐藥肺炎克雷伯菌的藥物主要有β-內酰胺類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、多黏菌素和替加環素等。這些藥物使用時易出現耐藥性或肝腎毒性等特點[30-31]。所以治療多重耐藥肺炎克雷伯菌的用藥選擇是臨床的一大難題。本實驗通過研究銅綠假單胞菌和多重耐藥肺炎克雷伯菌種間關系，發現銅綠假單胞菌可顯著抑制多重耐藥肺炎克雷伯菌的生長，兩者之間可能存在互作關系，這可能是治療多重耐藥肺炎克雷伯菌新的突破口。

呼吸道里面寄居著固有的微生物菌群。當機體發生感染時，固有微生物菌群會發生改變。研究報道這些微生物菌群間存在拮抗關系。Pettigrew等[32]對臨床986份咽拭子研究發現，流感嗜血桿菌的定植量與肺炎鏈球菌、黏膜炎莫拉菌以及金黃色葡萄球菌的定植量呈負相關。Lewnard團隊[33]在探究流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌及金黃色葡萄球菌間的菌群關系的研究中，在6764份咽拭子中發現肺炎鏈球菌和流感嗜血桿菌的定植量與金黃色葡萄球菌定植量成反比，進一步證明了病原菌間存在拮抗關系。本實驗在體外研究了銅綠假單胞菌與多重耐藥肺炎克雷伯菌間的相互作用關系。共培養模型中，共培養前4 d，PA菌落數量均多于MDR-KP8菌落數，共培養72 h后MDR-KP8菌落數顯著下降，而PA菌落數下降程度低于MDR-KP8。平板互作實驗中，隨著PA與MDR-KP8間距離的由近到遠，MDR-KP8的菌落面積由小變大，PA菌落面積未觀察到明顯變化，該結果更加清晰展現了PA對MDR-KP8的抑制作用。進一步對菌株的上清液進行提取定量，發現MDR-KP8的存在誘導了PA的群體感應系統（PQS），使其分泌更多的毒力因子（如鼠李糖脂和綠膿素等）。上清液活性探究實驗證明PA上清液中綠膿素顯著抑制了MDR-KP8的生長，具有顯著性差異（P＜0.0001），但鼠李糖脂對MDR-KP8的生長并未呈現出抑制作用。體外實驗證明PA與MDR-KP8間存在拮抗關系。

微生物菌群拮抗關系被大量報道，其機制一直備受關注。研究發現銅綠假單胞菌與其它致病菌相比，銅綠假單胞菌形成了一套復雜的群體感應系統（PQS），分別是las系統、rhl系統、iqs系統和pqs系統。當銅綠假單胞菌受到外界環境壓力時，會立刻啟動PQS賦予銅綠假單菌快速適應極端惡劣環境的能力。當營養物質缺乏時，處于級聯反應頂端的las系統會出現突變并誘導下層聯級系統。Las突變和低磷情況下，IQS的生物合成受到促進，毒力因子如綠膿菌素、鼠李糖脂和彈性酶的分泌增加[17，34-36]。Cao等[37]在研究銅綠假單胞菌面對其他細菌競爭壓力產生PQS信號分布情況時，通過拉曼光譜成像技術發現與單獨培養銅綠假單胞菌出現PQS相比，與大腸埃希菌共培養時PQS產生提前了

48 h；進一步在銅綠假單胞菌生長的邊緣滴加大腸埃希菌或者金黃色葡萄球菌上清液，培養6 h后就能檢測到PQS信號，其機制可能是上清液刺激了銅綠假單胞菌產生膜囊泡（OMV），進一步刺激PQS的產生。Horspool等[38-39]研究與上述一致。本實驗中銅綠假單胞菌與多重耐藥肺炎克雷伯菌共培養產生的鼠李糖脂與綠膿素含量遠遠超過單獨培養所產生的含量，可能是多重耐藥肺炎克雷伯菌上清液刺激了銅綠假單胞菌OMV的產生，進一步使PQS的含量增加，綠膿素和鼠李糖脂的含量增加。實驗中進一步對這兩種物質進行提取和活性測試，顯示綠膿素對MDR-KP8敏感，其MIC為128 μg/mL。進一步對抗菌機制研究，發現與綠膿素共孵育后，與對照組相比菌株上清液中核酸、蛋白質及堿性磷酸酶含量不斷增加，胞內脂質、蛋白質、核酸官能團結構發生變化。表明綠膿素增大了細菌細胞膜的通透性，進一步使細胞壁結構遭到破壞，使胞內物質釋放到至外環境中，導致細胞無法進行正常生命活動而死亡[40-41]。

綜上，菌群拮抗原理是一種新的抗感染策略。本實驗在體外證明了銅綠假單胞菌有拮抗多重耐藥肺炎克雷伯菌的作用及其機制，一定程度上為臨床利用菌群拮抗原理治療多重耐藥肺炎克雷伯菌感染提供實驗依據。

參 考 文 獻

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