HBV相關慢加急性肝衰竭恢復期患者肝組織HBV cccDNA水平及其臨床意義

摘要： 目的 觀察HBV cccDNA在HBV相關慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）恢復期患者肝組織中的表達水平，并探討其與HBV標志物、肝組織病理改變的關系。方法 選取2015年1月—2023年10月在南昌市第九醫院住院的HBV-ACLF恢復期患者30例為肝衰竭組，另選取同期9例性別及年齡匹配的慢性乙型肝炎患者（CHB）作為對照組，檢測肝組織HBV cccDNA水平，并分析其與臨床資料、實驗室檢查指標的關聯性。計量資料兩組間比較采用成組t檢驗或Mann-Whitney U檢驗；多組間比較采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis H檢驗。計數資料組間比較采用Fisher精確檢驗。相關性分析采用Spearman相關分析。結果 肝衰竭組肝組織 HBV cccDNA 水平顯著低于對照組［（?0. 92±0. 70） log 10 copies/cell vs （?0. 13±0. 91）log 10 copies/cell，t=2. 761，P=0. 009］。肝衰竭組中，血清HBeAg陽性與陰性患者肝組織HBV cccDNA水平比較，差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；肝組織炎癥活動度G0～G2級、G3級、G4級患者的肝組織HBV cccDNA水平比較，差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；肝組織纖維化程度S0～S2期、S3期、S4期患者的肝組織HBV cccDNA水平比較，差異無統計學意義（Pgt;0. 05）；血清HBV DNA陰性與血清HBV DNA陽性患者肝組織HBV cccDNA水平比較，差異無統計學意義（Pgt;0. 05）。肝衰竭組肝組織HBV cccDNA水平與肝組織HBV DNA水平呈正相關（r=0. 426，P=0. 043），與血清HBV DNA水平無明顯相關性（Pgt;0. 05）。

結論 肝組織HBV cccDNA水平在HBV-ACLF恢復期明顯降低，肝組織HBV cccDNA持續穩定存在，較血清及肝組織HBVDNA更能反映HBV的持續感染與復制。

關鍵詞： 乙型肝炎病毒； 慢加急性肝功能衰竭； 恢復期； 共價閉合環狀DNA

The level of HBV cccDNA in liver tissue and its clinical significance in patients in the convalescence stage ofhepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure

CAI Zhekai a ， XU Long a ， LIU Wenli b ， XIAO Yingqun b ， ZHONG Qingmei b ， ZHANG Wei a ， WU Min aa. Department of Chronic Liver Diseases， b. Department of Pathology， The Ninth Hospital of Nanchang， Nanchang 330002， China

Corresponding author： XU Long， xulong791@126.com （ORCID： 0009-0004-9918-3237）

Abstract： Objective To investigate the expression level of HBV cccDNA in patients in the convalescence stage of hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure （HBV-ACLF） and its correlation with HBV markers and liver histopathological changes. Methods Atotal of 30 patients in the convalescence stage of HBV-ACL who were hospitalized in The Ninth Hospital of Nanchang from January 2015to October 2023 were enrolled as liver failure group， and 9 patients with chronic hepatitis B （CHB）， matched for sex and age， wereenrolled as control group. The content of HBV cccDNA in liver tissue was measured， and its correlation with clinical data and laboratorymarkers was analyzed. The independent-samples t test or the Mann-Whitney U test was used for comparison of continuous data betweentwo groups， and a one-way analysis of variance or the Kruskal-Wallis H test was used for comparison between multiple groups； the Fisher’s exact test was used for comparison of categorical data between groups. A Spearman correlation analysis was performed. Results Theliver failure group had a significantly lower content of HBV cccDNA in liver tissue than the control group （?0.92±0.70 log 10 copies/cell vs?0.13±0.91 log 10 copies/cell， t=2.761， P=0.009）. In the liver failure group， there was no significant difference in the content of HBV cccDNA in liver tissue between the HBeAg-positive patients and the HBeAg-negative patients （Pgt;0.05）； there was no significantdifference in the content of HBV cccDNA in liver tissue between the patients with different grades （G0-G2， G3， and G4） of liverinflammatory activity （Pgt;0.05）； there was no significant difference in the content of HBV cccDNA in liver tissue between the patientswith different stages （S0-S2， S3， and S4） of liver fibrosis （Pgt;0.05）； there was no significant difference in the content of HBV cccDNAin liver tissue between the patients with negative HBV DNA and those with positive HBV DNA （Pgt;0.05）. For the liver failure group， thecontent of HBV cccDNA in liver tissue was positively correlated with the content of HBV DNA in liver tissue （r=0.426， P=0.043） andwas not significantly correlated with the content of HBV DNA in serum （Pgt;0.05）. Conclusion There is a significant reduction in thecontent of HBV cccDNA in liver tissue in the convalescence stage of HBV-ACLF. HBV cccDNA exists continuously and stably in livertissue and can better reflect the persistent infection and replication of HBV than HBV DNA in serum and liver tissue.

Key words： Hepatitis B Virus； Acute-On-Chronic Liver Failure； Convalescence； Covalently Closed Circular DNA

慢加急性肝衰竭（ACLF）是一類以慢性肝病為基礎，發生急性肝功能失代償、肝外器官衰竭和短期高病死率為主要特征的嚴重臨床綜合征［1-2］ 。HBV 的再活動是ACLF最常見的急性病因［3-4］ 。2018年國內一項多中心、前瞻性研究［5］結果顯示，71. 5%的患者為HBV相關ACLF（HBV-ACLF）。有研究［6］ 發現，當血清HBV DNA水平降至檢測值以下時，肝組織中仍能夠檢測到HBV cccDNA。

因此，肝內HBV cccDNA水平在病情監測和評估抗HBV治療效果方面可作為更好的評價指標。本研究通過聚合酶鏈式反應（PCR）-熒光探針法定量檢測HBV-ACLF恢復期患者肝組織的 HBV cccDNA 含量，并探討其與HBV標志物、肝組織病理改變的關系，以期為cccDNA的穩定性與持久性相關研究提供新的見解。

1 資料與方法

1. 1 研究對象 選取 2015年 1月—2023年 10月在本院住院的HBV-ACLF恢復期患者納入肝衰竭組，另隨機選取同期住院、性別及年齡匹配的慢性乙型肝炎（CHB）患者作為對照組。肝衰竭患者符合《肝衰竭診治指南（2018年版）》［2］的ACLF診斷標準；行肝穿刺活檢時血清TBil≤85. 5 μmol/L，凝血酶原活動度（PTA）gt;60%，PLTgt;80×10 9 /L。CHB患者符合《慢性乙型肝炎防治指南（2022年版）》［7］ 的診斷標準。所有研究對象均排除CHB以外的其他慢性肝病史，如酒精性肝病、脂肪性肝病等；排除伴有除肝炎相關以外的嚴重臟器功能損害、惡性腫瘤等；排除近期使用免疫抑制劑治療者。所有研究對象入院時均給予核苷（酸）類似物（NUC）抗病毒治療。

1. 2 資料收集 記錄研究對象住院期間相關資料，包括年齡、性別、ALT、TBil、血肌酐（SCr）、PTA、血清 HBVDNA、肝組織HBV DNA、肝組織病理診斷結果等。MELD評分計算公式=3. 78ln［TBil（mg/dL）］+11. 2ln（INR）+9. 57ln［SCr （mg/dL）］+6. 4。

1. 3 標本采集與測定 研究對象通過彩色B超肝穿刺活檢術定位，于病房行肝穿刺活檢，保證肝組織常規病理檢查要求，取剩余肝組織置入組織RNA保養液，?70 ℃冰箱保存備用。采用實時定量 PCR 檢測肝組織 HBVDNA，使用廣州海力特生物科技有限公司HBV cccDNA定量檢測試劑盒，通過 PCR-熒光探針法測定肝組織HBV cccDNA。實驗步驟：利用凱杰提取試劑盒提取肝組織核酸，使用蛋白酶K和組織裂解液對肝組織進行消化處理，提取純化核酸后，取10 μL核酸加入40 μL PSAD酶切體系（1 μL PSAD酶+39 μL Buffer），進行37 ℃ 30 min孵育酶切，然后立即70 ℃ 30 min滅活酶系，酶切后的核酸作為PCR模板在FAM熒光通道擴增用于HBV cccDNA定量，未經酶切的核酸上樣后選擇VIC熒光通道擴增用于細胞定量。所有實驗步驟均嚴格按照試劑說明書操作，確保檢測結果的準確性和可靠性。

1. 4 統計學方法 應用SPSS 26. 0統計軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以 x ˉ ±s表示，兩組間比較采用成組t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析；非正態分布的計量資料以M（P 25 ～P 75 ）表示，兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗，多組間比較采用Kruskal-Wallis H檢驗。

計數資料組間比較采用Fisher精確檢驗。采用Spearman檢驗進行相關性分析。Plt;0. 05為差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 一般資料 本研究共納入 39 例患者，男 37 例（94. 87%），女2例（5. 13%），平均年齡（32. 92±7. 98）歲。其中HBV-ACLF恢復期患者30例，CHB患者9例，兩組患者一般資料比較，年齡、性別、ALT、SCr、血清HBV DNA以及肝組織 HBV DNA 差異均無統計學意義（P 值均gt;0. 05），對照組患者 PTA 明顯高于肝衰竭組（Plt;0. 05）（表1）。

2. 2 肝組織 HBV cccDNA 水平比較 肝衰竭組患者肝組織 HBV cccDNA 水平低于對照組［（?0. 92±0. 70）log 10 copies/cell vs （?0. 13±0. 91） log 10 copies/cell］，差異有統計學意義（t=2. 761，P=0. 009）。

2. 3 肝組織 HBV cccDNA 水平與血清 HBeAg 的關系在肝衰竭組中，血清HBeAg陽性與HBeAg陰性各15例。HBeAg 陰性和陽性患者年齡、性別、ALT、SCr、PTA、MELD評分、血清HBV DNA、肝組織HBV DNA以及肝組織 HBV cccDNA 比較，差異均無統計學意義（P 值均gt;0. 05）（表2）。

2. 4 肝組織HBV cccDNA水平與肝組織炎癥程度及纖維化程度的關系 根據肝臟病理診斷對肝衰竭組患者進一步分析，結果顯示，肝組織炎癥活動度G0～G2級、G3級、G4級患者年齡、性別、血清和肝組織HBV DNA、肝組織HBV cccDNA比較，差異均無統計學意義（P值均gt;0. 05）（表3）。肝組織纖維化程度S0～S2期、S3期、S4期患者年齡、性別、血清和肝組織HBV DNA、肝組織HBV cccDNA比較，差異亦均無統計學意義（P值均gt;0. 05）（表4）。

2. 5 肝組織 HBV cccDNA 水平與血清 HBV DNA 的關系 根據血清 HBV DNA 檢測下限（5. 0×10 2 IU/mL）將HBV-ACLF恢復期患者分為血清HBV DNA陰性組和血清HBV DNA陽性組。結果顯示，血清HBV DNA陰性組與陽性組患者年齡、性別、ALT、SCr、PTA、MELD評分、抗病毒治療時間、入院時血清HBV DNA、肝組織HBV cccDNA比較，差異均無統計學意義（P值均gt;0. 05）（表5）。

2. 6 肝組織 HBV cccDNA 水平與血清及肝組織 HBVDNA的相關性分析 相關分析結果顯示，肝衰竭組患者肝組織HBV cccDNA水平與血清HBV DNA水平無明顯相關性（r=?0. 078，P=0. 688），與肝組織HBV DNA水平呈正相關（r=0. 426，P=0. 043）。

3 討論

HBV是一種特異性靶向肝細胞的雙鏈 DNA病毒，通過病毒包膜蛋白與硫酸乙酰肝素蛋白多糖結合，附著于宿主細胞表面，在牛磺膽酸鈉協同轉運多肽的作用下促進病毒進入細胞質［8］ ，病毒顆粒從包膜釋放核衣殼，核衣殼分解導致病毒基因組進入到細胞核形成松弛環狀DNA（relaxed circular DNA， rcDNA），部分rcDNA轉化為 cccDNA［9-10］ 。HBV cccDNA 兼具病毒轉錄復制模板和基因儲存庫的功能［11］ 。HBV通過HBV基因組的細胞內再循環和繼發感染維持穩定的cccDNA庫。因此，通過肝組織中的HBV cccDNA水平可以準確地了解HBV復制是否活躍及其活躍程度，而抑制病毒復制可以防止cccDNA庫的更新。

本研究結果顯示，與CHB患者相比，HBV-ACLF恢復期患者肝組織HBV cccDNA水平顯著降低，而兩組間血清及肝組織HBV DNA水平無明顯差異。CHB患者入院后均口服抗病毒藥物，包括恩替卡韋或替諾福韋等NUC，同時給予護肝、退黃、降酶等內科綜合治療。對于ACLF患者，均臥床休息，維持電解質或酸堿平衡，預防和治療并發癥，在內科綜合治療的基礎上，必要時聯合人工肝治療。目前認為，機體的免疫系統清除HBV cccDNA有兩種機制。一種是細胞溶解作用，通過肝細胞分裂可導致 cccDNA 丟失。增殖肝細胞對 HBV的再感染具有抵抗力，可能與HBV的功能性受體牛磺膽酸鈉共轉運受體表達水平降低，在肝細胞膜上的分布減少相關［12］。另一種為非細胞溶解作用，通過細胞毒性T淋巴細胞殺死感染的肝細胞。Lutgehetmann等［13］ 研究報道，在肝再生且未使用抗病毒藥物的情況下，細胞分裂會引起cccDNA庫的強烈不穩定，導致大多數慢性感染的肝細胞中cccDNA被清除。在人嵌合小鼠的肝臟中，即使不涉及溶細胞機制，人肝細胞分裂也會引發大量cccDNA損失［14］。筆者推測，在 ACLF恢復期，免疫介導的肝細胞損傷和代償性肝細胞增殖均可能導致 cccDNA 清除。肝組織cccDNA較血清及肝組織HBV DNA可更好地反映肝損傷后修復這一病理生理過程。

此外，本研究探討了恢復期肝組織HBV cccDNA能否作為ACLF疾病嚴重程度的評估指標，發現HBV cccDNA水平與肝組織炎癥及纖維化程度無關。有研究［15］報道，HBeAg狀態與 HBV-ACLF嚴重程度相關。HBeAg陰性HBV-ACLF患者的病情較HBeAg陽性患者更重，可能與部分HBeAg陰性HBV-ACLF患者體內存在HBV前C區變異、T淋巴細胞亞群紊亂等因素相關。本研究并未發現HBeAg陽性組和陰性組的肝組織HBV cccDNA水平有統計學差異。上述結果表明，恢復期肝組織HBV cccDNA不能反映ACLF嚴重程度。可能的原因是HBV-ACLF患者肝臟的損傷是HBV激發機體免疫反應，損傷肝細胞，而不是HBV復制的直接結果［16］ 。此外，本研究檢測ACLF患者恢復期肝組織 HBV cccDNA，而不是治療前 HBVcccDNA。如前所述，恢復期肝組織HBV cccDNA的降低是肝損傷和修復共同導致，因此不能反映肝衰竭嚴重程度，在CHB患者中亦有相同的結論［17］。

NUC 靶向 HBV 聚合酶的逆轉錄活性，抑制 HBVDNA的生物合成，從而將病毒血癥控制在無法檢測的水平，并使ALT水平恢復正常［11］。然而，NUC的眾多益處不包括HBV cccDNA的消除。NUC不靶向HBV cccDNA，使其在感染的肝細胞中持續存在。在本研究中，HBV-ACLF恢復期患者肝組織HBV cccDNA的水平與肝組織HBV DNA水平呈正相關，與血清HBV DNA水平無明顯相關性。有研究［16］顯示，在CHB患者中，肝組織HBV cccDNA水平與肝組織HBV DNA水平呈高度相關性。本研究結果證實，使用NUC抗病毒治療的HBV-ACLF患者中，當血清HBV DNAlt;5. 0×10 2 IU/mL時，肝組織內仍可維持一定水平的cccDNA，血清HBV DNA的水平并不能完全真實地反映肝組織內HBV復制及其活躍程度，停藥后容易復發，導致抗病毒治療失敗［18］。復旦大學袁正宏教授團隊［19］ 對CHB患者肝組織進行原位cccDNA檢測發現，阿德福韋長期治療雖然可使血清HBV DNA被抑制到檢測水平之下，肝內HBV抗原水平和細胞質HBV DNA水平大幅降低，但肝細胞核內仍可檢測到一定水平的cccDNA，與本研究結果一致。cccDNA很難通過NUC治療而被徹底清除，并且只要機體未建立有效的抗HBV免疫應答，肝細胞核內殘存的cccDNA在停藥后很容易實現回補及恢復病毒復制［20］。

綜上所述，HBV-ACLF恢復期患者肝組織HBV cccDNA水平可能與感染肝細胞的大量壞死和增殖相關，其含量與HBV標志物、肝組織炎癥及纖維化程度關系不密切，可能與HBV-ACLF處于恢復期有關，肝組織HBV cccDNA的水平與肝組織HBV DNA具有相關性，較血清及肝組織HBV DNA 水平更能反映 HBV 的持續感染與復制。然而，關于HBV cccDNA在ACLF中的臨床應用價值還需更大樣本量的研究。

倫理學聲明： 本研究方案于2023年7月3日經由南昌市第九醫院倫理委員會審批，批號：［2023］倫審字（34）號。

利益沖突聲明： 本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻聲明： 蔡哲凱負責研究設計，數據整理，統計分析，文章撰寫；張偉、吳敏負責樣本收集，數據整理；劉文麗、鐘青梅負責病理診斷，實驗操作，資料整理；肖影群負責病理診斷質控及論文審閱；徐龍負責研究設計指導，論文審閱。

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收稿日期：2024-05-17；錄用日期：2024-07-10

本文編輯：葛俊