3種石斛種子無菌播種快繁技術

摘要 為了解鼓槌石斛、細莖石斛和球花石斛種子無菌播種快繁技術，以3種石斛種子為研究對象，探討不同培養基、激素種類以及濃度配比對3種石斛種子無菌萌發、原球莖增殖和種苗壯苗生根的影響。結果表明：3種石斛種子的萌發率最高均在1/2MS基礎培養基和添加10%馬鈴薯的1/2MS培養基上；鼓槌石斛和球花石斛原球莖增殖培養基以1/2MS+10%馬鈴薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA最佳，細莖石斛原球莖增殖培養基以1/2MS+10%馬鈴薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA最佳；鼓槌石斛生根壯苗培養基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂最佳，球花石斛和細莖石斛的生根壯苗培養基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂最佳。

關鍵詞 石斛屬；無菌萌發；原球莖增殖；壯苗生根

中圖分類號 S 567.23 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2024）20-0155-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2024.20.038

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Rapid Propagation Technique of 3 Kinds of Dendrobium Seeds

LINGHU Ke-nian，YANG Yan-bing，YAN Feng-xia et al

（Key Laboratory of National Forestry and Grassland Administration on Biodiversity Conservation in Karst Mountainous Areas of Southwestern China，Guizhou Academy of Forestry，Guiyang，Guizhou 550005）

Abstract To understand the Dendrbium chrysotoxum，Dendrobium moniliforme and Dendrobium thyrsiflorum seed sterile plant rapid propagation techniques，in this paper，three kinds of Dendrobium seeds as the research object，discusses different types of medium，hormone and concentration ratio of 3 kinds of Dendrobium sterile seed germination，protocorm proliferation and seedling seedling rooting effect.The results showed that the highest germination rate of the 3 Dendrobium seeds was on 1/2MS base culture and 1/2MS medium with 10% potato.Dendrobium chrysotoxum and Dendrobium thyrsiflorum were optimized with 1/2MS +10% potato +0.50 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA，while Dendrobium moniliforme was optimized with 1/2MS +10% potato +1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA.The best rooting and seedling medium of Dendrobium chrysotoxum moniliforme was 1/2MS+0.10 mg/L IBA+10% potato +2.0% sucrose +0.6% AGAR，and the best rooting and seedling medium of Dendrobium thyrsiflorum and Dendrobium moniliforme was 1/2MS+0.50 mg/L IBA+10% potato +2.0% sucrose +0.6% AGAR.

Key words Dendrobium spp.;Sterile germination;Protocorm proliferation;Strong seedling rooting

石斛（Dendrobium spp.）是蘭科（Orchidaceae）石斛屬（Dendrobium Sw.）植物的總稱，全世界約有1 500個原始種，13 600余個雜交種［1-2］。早期記載我國共有72種和2個變種［3］，但隨著新種和新紀錄的發現，我國石斛屬植物已上升至81種，分布在西南、華南等熱帶、亞熱帶地區以及秦嶺以南各省［4］。石斛莖含有生物堿、多糖、黃酮等多種藥用成分［5］，具有良好的抗腫瘤、抗衰老、抗氧化、降血糖以及提高免疫力等藥用功效［6-8］，是著名的傳統中藥材。同時，由于石斛種類繁多、花形多樣、花色豐富、花期長，亦極具觀賞價值，民間常稱“石斛蘭”，是世界“四大洋蘭”之一［9-11］。

作為附生的蘭科植物，對環境要求嚴［12-13］，高度特化與艷麗的花特征，致使其傳粉受精需要特定形態昆蟲，自然狀態下授粉困難，結實率低；此外，其種子無胚乳，需特定的共生菌為其提供營養才能正常萌發，自然更新困難［14-16］。加之人為過度采挖，受威脅嚴重，野生資源極度稀少，在《中國生物多樣性紅色名錄——高等植物卷（2020）》中已有42種石斛被評估為極危（CR）或瀕危（EN）物種，且2021年9月發布的《國家重點保護植物名錄》中，石斛所有種均列為國家重點保護植物。因此，開展石斛擴繁技術研究對石斛資源保護意義重大。

目前，石斛主要依靠分株繁殖，繁育能力低下且生長緩慢，存在繁殖系數低、周期長等缺陷［16］。近年來，隨著組培快繁技術快速發展，翅萼石斛、鐵皮石斛等均突破了快速擴繁技術瓶頸，并取得了顯著成效［17-18］，為石斛資源的保育與可持續利用提供了重要基礎。鑒于此，筆者以鼓槌石斛、細莖石斛和球花石斛3種石斛種子為材料，探討不同的基礎培養基、天然有機添加物、激素種類和激素濃度配比對石斛種子萌發率、原球莖增殖以及生根壯苗等的影響，旨在通過快繁技術建立3種石斛的規模化技術體系，為石斛資源的保育與可持續利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料來自貴州省林業科學研究院貴州·石斛種質資源庫，是經人工授粉后的鼓槌石斛（Dendrobium chrysotoxum）、細莖石斛（Dendrobium moniliforme）和球花石斛（Dendrobium thyrsiflorum）的蒴果。其中，鼓槌石斛5月中旬開花，7 d后進行人工授粉，11月初果實成熟，孕育期170 d；細莖石斛6—11月陸續開花，11月初開花，10 d左右進行人工授粉，次年6月中旬果實成熟，孕育期210 d；球花石斛6月初開花，7 d左右人工授粉，12月初果實成熟，孕育期160 d。

_{zrqFmMhW+g+SmH8UDWnwgw==}1.2 方法

1.2.1 培養條件。

試驗采用MS、1/2MS、B5、1/2B5作為基礎培養基，篩選最優基礎培養基后附加一定量的植物生長調節劑（6-BA、NAA、IAA、IBA）和10%天然有機附加物（馬鈴薯、香蕉、玉米、大豆），所有培養基均以加入0.5 g/L活性炭、葡萄糖20 g/L（生根為10 g/L）及6 g/L瓊脂作為固定劑，加熱完全融化后調pH在5.2～5.4，分裝入培養瓶中，每瓶40 mL，用瓶蓋封口，每處理接種20瓶，放置于蒸氣高壓鍋內（壓力1.05 kg/cm2，溫度121 ℃，維持20 min）消毒，室溫冷卻后待用。3種石斛種子無菌萌發各階段培養基所含天然添加物、激素配比和濃度見表1。

1.2.2 培養環境。

接種材料各生長階段的培養在培養室完成，將接種材料置于培養室中每層具2支40 W的日光燈的培養架上培養，培養室溫度維持在（25±2）℃，光照強度30～40 μmol/（m2·s），光照時間12 h/d。

1.2.3 種子消毒。

建立無菌培養物時，外植體表面滅菌關系到試驗成敗，因此在石斛的組培研究中，待果實漸變為淡黃色時，剪取成熟未開裂飽滿果實，先將石斛果實在自來水下沖洗3～4 h，乙醇消毒5 min，取出置于10％次氯酸鈉溶液中浸泡5 min，之后用0.1％升汞溶液浸泡5 min，無菌水沖洗3～4次，無菌濾紙吸干表面水分，備用。

1.2.4 種子撒播與萌發。

在超凈工作臺上無菌條件下切開果皮，用接種器具將種子撒落于所配制的MS、1/2MS、B5、1/2B5固體瓊脂培養基上，以篩選基礎培養基對石斛種子萌發的影響；另將同一批種子分別接種于添加10%天然有機附加物馬鈴薯、香蕉、玉米和大豆的1/2MS基礎培養上。

1.2.5 原球莖增殖與分化。

將原球莖轉接于增殖分化培養基上，基礎培養基選用1/2MS+10%馬鈴薯，并添加不同激素濃度6-BA和NAA（表1），觀察3種石斛原球莖分化增殖情況。

1.2.6 壯苗生根。

當種子萌發培養基中石斛原球莖長出1 cm 及以上的芽后，將其轉接至壯苗生根培養基中進行生根壯苗試驗。培養基配方：以1/2MS+10%馬鈴薯+0.5 g/L活性炭+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂為基礎培養基，并添加不同濃度IBA（0.05、0.10、0.50和1.00 mg/L）。

1.3 數據處理

采用Excel軟件對試驗數據進行統計處理。

萌發率=（萌發瓶數/接種瓶數）×100%

增殖率=（增殖數/接種數）×100%

生根率=（生根數/接種數）×100%

2 結果與分析

2.1 不同培養基對3種石斛種子萌發的影響

分別以MS、1/2MS、B5、1/2B5為基礎培養基，將3種石斛種子（圖1：A1、B1、C1）分別接種到不同萌發基礎培養基D1～D4上（表2），接種后置于光照下培養28 d（圖1：A2、B2、C2），可見種子由白色轉為綠色，49 d葉原基長出，77 d后原球莖長成小芽（圖1：A3、B3、C3），觀察統計種子在各培養基中的萌發情況。結果發現（表2），3種石斛種子在1/2MS培養基上萌發數和萌發率最高，鼓槌石斛、球花石斛和細莖石斛的萌發率分別達到85%、65%和100%，以細莖石斛的萌發率最高，鼓槌石斛其次，球花石斛最低。

2.2 不同有機添加物對3種石斛種子萌發的影響

以1/2MS為基礎培養基，將鼓槌石斛、球花石斛和細莖石斛種子分別接種到添加10%的馬鈴薯、香蕉、玉米、大豆4種培養基E1～E4上（表3）。由表3可知，種子接入以上培養基均能萌發，但萌發率各有不同。4種有機添加物中，3種石斛種子在添加10%馬鈴薯的培養基上萌發數和萌發率最高，萌發率高達85%及以上。其他3種有機添加物雖然萌發率均低于馬鈴薯，但并無褐化現象，原球莖之間不黏連，有利于轉瓶繼代培養。

2.3 不同激素組合對3種石斛原球莖增殖與分化的影響

以1/2MS為基礎培養基，添加10%馬鈴薯及不同配比的激素組合（6-BA和NAA），將原球莖及帶有葉芽的原球莖轉接至不同激素組合及配比的培養基F1～F6上（表4、圖1：A4、B4、C4）。鼓槌石斛培養基上原球莖及芽增殖速度較慢，少量植株有嚴重褐化現象，其余2種石斛均正常發育（圖1：A5、B5、C5）。當細胞分裂素6-BA為0.2 mg/L條件下，NAA濃度為0.2 mg/L時，3種石斛植物的分化增殖率最高，之后隨著NAA濃度的增加，3種石斛植株的分化均呈下降趨勢，說明生長素NAA的濃度以0.2 mg/L為宜，NAA濃度≥0.5 mg/L有抑制植株分化的趨勢。

在生長素NAA為0.2 mg/L條件下（F1～F3），隨著細胞分裂素6-BA濃度的增加，鼓槌石斛和球花石斛原球莖的增殖數和增殖率呈下降趨勢，說明0.5 mg/L 6-BA適宜誘導鼓槌石斛和球花石斛增殖；對細莖石斛來說，隨著6-BA濃度的增加，原球莖的增殖數和增殖率呈先上升后下降的趨勢，6-BA濃度為1.0 mg/L時，細莖石斛增殖數和增殖率最高，表明1.0 mg/L 6-BA濃度能明顯促進細莖石斛增殖。因此，鼓槌石斛和球花石斛原球莖增殖較適宜的培養基為1/2MS+10%馬鈴薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；細莖石斛原球莖增殖適宜的培養基為1/2MS+10%馬鈴薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

2.4 不同激素組合配比對3種石斛壯苗生根的影響

以1/2MS為基礎培養基，添加10%馬鈴薯及不同濃度IBA，將較大的無根苗轉入生根培養基G1～G4上培養（表5）。觀察G1～G4培養基發現，培養28 d左右，植株生長旺盛，3種石斛均長出2～3條1～3 cm長的根（圖1：A6、B6、C6）。隨著IBA濃度的增加，3種石斛種苗的生根數和生根率均呈先上升然后下降趨勢。當IBA為0.10 mg/L時，鼓槌石斛生根率達95.0%，高于0.10 mg/L時，該種的生根率降低，表明低濃度的IBA有利于鼓槌石斛根的產生，高濃度IBA對根的誘導及萌發有抑制作用。當IBA濃度為0.50 mg/L時，球花石斛和細莖石斛生根數和生根率達到最高，分別為87.5%和100%，且根呈綠色，根與根之間有相互纏繞，植株生長旺盛，無褐化現象，因此鼓槌石斛的生根培養基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂為宜；球花石斛和細莖石斛的生根培養基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂為宜。

3 討論

3.1 基礎培養基對3種石斛種子萌發和原球莖誘導的影響

自然條件下的石斛種子存在萌發困難、萌發率低等問題，隨著無菌播種快繁技術的應用，越來越多的石斛屬植物播種技術趨于成熟。適宜的基礎培養基為種子萌發提供所需要的養分和水分，是提高種子萌發率的基礎。在該試驗中，用MS、1/2MS、B5和1/2B5培養基誘導鼓槌石斛、球花石斛和細莖石斛種子萌發，結果表明，4種培養基均能促使石斛種子萌發，但在1/2MS培養基上3種石斛種子的萌發數和萌發率最高。這可能是由于不同培養基所含元素和濃度不同，進而影響種子的萌發率；同時，與張梅等［19-20］研究結果相似，低濃度無機鹽培養基更能促進種子萌發。

種子萌發還受天然有機添加物的影響，適宜的天然有機添加物能為種子萌發提供礦質元素和養分。該研究結果表明，接種于分別添加10%馬鈴薯、10%香蕉、10%玉米和10%大豆的4種培養基上的3種石斛種子均能萌發，其中以添加10%馬鈴薯培養基上的萌發數和萌發率最高，高達85%及以上。這表明種子萌發期間需要營養支持，而相較于其他天然有機添加物，10%馬鈴薯對石斛種子萌發的促進效果最好，這可能與馬鈴薯富含維生素（B1和B2）和礦質元素（鉀、鐵、鎂以及碳水化合物和氨基酸）有關［21-22］。此外，Miransari等［23］研究認為，種子在萌發過程中需要大量的氮，因而在培養基中添加馬鈴薯會提高種子的發芽率。

3.2 不同激素配比對3種石斛原球莖分化增殖的影響

石斛屬植物擴繁的關鍵時期是原球莖增殖和叢生芽誘導階段，試驗中常采用激素處理并添加一定量的細胞分裂素來提高增殖誘導效果［18］。石斛原球莖對激素的需求較為敏感，分化程度也越高，張梅等［19，24］研究認為，0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA培養基中原球莖的分化效果最佳，與該研究結果相同。當細胞分裂素6-BA為0.2 mg/L條件下，NAA濃度為0.2 mg/L時，3種石斛植物的分化率最高，之后隨著NAA濃度的增加，3種石斛植株的分化均呈下降趨勢；生長素NAA為0.2 mg/L條件下，細胞分裂素6-BA濃度為0.5 mg/L時，鼓槌石斛和球花石斛原球莖增殖率最高；6-BA濃度為1.0 mg/L時，細莖石斛增殖分化率最高。這表明在培養基含有低濃度的細胞分裂素時，只有低濃度的NAA能有效促進石斛原球莖的增殖率，高濃度NAA反而對原球莖的增殖起抑制作用。在低濃度NAA（0.2 mg/L）培養基中，低濃度的6-BA（0.2 mg/L）能有效促進鼓槌石斛和球花石斛原球莖的增殖，中等濃度NAA（1.0 mg/L）則促進細莖石斛原球莖增殖，高濃度NAA均抑制石斛原球莖增殖，說明3種石斛原球莖的誘導在低、中濃度的生長素NAA和細胞分裂素6-BA中最佳，因此鼓槌石斛和球花石斛分化較適宜的培養基為1/2MS+10%馬鈴薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；細莖石斛適宜的培養基為1/2MS+10%馬鈴薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。

3.3 不同外源激素對3種石斛種苗壯苗生根的影響

壯苗生根階段是植物組織培養的重要階段之一，常在培養基中使用一定量的激素誘導石斛種苗壯苗生根［25］。如張書萍等［26-27］研究認為，添加一定量的激素IBA能有效促進石斛苗生根。該研究發現，3種石斛種子的生根數和生根率隨IBA濃度增加均呈先上升后下降的趨勢，當IBA為0.10 mg/L時誘導的鼓槌石斛生根率最高，為95.0%，當IBA濃度為0.50 mg/L時誘導的球花石斛和細莖石斛生根數和生根率最高，分別為87.5%和100%，且根生長旺盛，無褐化現象。這說明IBA對石斛種苗生根壯苗的誘導效率與激素濃度有關，且不同種類石斛種苗所需激素濃度不同。羅玉婷等［28］研究發現，IBA濃度超過種苗適宜范圍，會導致苗矮化，長勢呈下降狀態，降低組培苗的質量。因此，通過研究得出鼓槌石斛的生根培養基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂為宜；球花石斛和細莖石斛的生根培養基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂為宜。

4 結論

通過大量的培養基篩選試驗，發現1/2MS培養基比MS、B5和1/2B5培養基更有利于3種石斛種子萌發；在1/2MS培養基中添加10%馬鈴薯比添加10%香蕉、10%玉米或10%大豆更能提高3種石斛種子的萌發率。3種石斛原球莖的誘導在低、中濃度生長素NAA和細胞分裂素6-BA中最佳，表現出鼓槌石斛和球花石斛原球莖增殖培養基為1/2MS+10%馬鈴薯+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA；細莖石斛原球莖適宜培養基為1/2MS+10%馬鈴薯+1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA。不同濃度對3種石斛生根壯苗效率不同，表現為鼓槌石斛的生根培養基以1/2MS+0.10 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂最佳；球花石斛和細莖石斛的生根培養基以1/2MS+0.50 mg/L IBA+10%馬鈴薯+2.0%蔗糖+0.6%瓊脂最佳。

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