基于核磁共振代謝組學特征構建膿毒癥患者短期死亡風險的預測模型及效能

摘要：目的" 探討基于核磁共振代謝組學特征構建膿毒癥患者短期死亡風險的預測模型的效果。方法" 選擇2020年1月～2022年12月我院ICU收治的60例膿毒癥患者作為訓練集。以治療后28 d時患者存活情況為分組標準，將所有患者分為存活組及死亡組。收集患者一般資料、實驗室檢查資料，在患者入組時搜集血清樣本進行質子核磁共振特異性代謝標志物分析，通過LASSO回歸篩選出排名前4的產物構建膿毒癥患者短期死亡風險預測模型。最后納入2023年1～12月于我院ICU治療的膿毒癥患者49例作為測試集對模型的預測效果進行驗證。結果" 死亡組患者APACHE II評分高于存活組，差異具有統計學意義（Plt;0.05）。多元統計分析方法顯示原始模型的預測能力大于任何1次隨機排列Y變量的預測能力，證明模型有效。無監督主成分分析得分散點圖共解釋了57%的變量（PC1=50%，PC2=7%），膿毒癥患者經PCPA造模后血清中內源性代謝物發生了顯著變化。OPLS-DA圖示模型擬合效果好，不存在特異點，兩組的分布區域完全分開。載荷矩陣圖顯示L-天門冬氨酸、吲哚乙酸、丙氨酸等水平升高，異亮氨酸、亮氨酸等水平下降。提取OPLS-DA模型中VIP值最大的前50個變量進行非參數檢驗，最后得到34個有統計學意義的變量（Plt;0.05），共有19個與膿毒癥死亡最有可能相關的特征代謝物。死亡組患者血清苯丙氨酸、肌酸、乙酰乙酸、谷氨酸、蛋氨酸、尿素、乳酸及氧化三甲胺顯著高于存活組（Plt;0.05）。使用LASSO篩選出的4個高相關的代謝產物，并建立的列線圖模型膿毒癥患者短期死亡風險的C-index分別為0.993（95% CI： 0.931～0.999）。列線圖模型預測訓練集的膿毒癥患者短期死亡風險（AUC=0.993，95% CI： 0.978～1.000，Plt;0.001）具有一定價值；將列線圖模型預測測試集的膿毒癥患者短期死亡風險（AUC=0.934，95% CI： 0.863～1.000，Plt;0.001）具有一定的使用價值。模型對訓練集預測的準確率分別為96.66%，敏感度分別為94.11%，特異度分別為97.60%。模型對驗證集預測的準確率分別為90.62%，敏感度分別為88.23%，特異度分別為91.48%。結論" 基于血清核磁共振代謝組學特征構建膿毒癥患者短期死亡風險的預測模型對于膿毒癥患者28 d死亡風險具有較好的預測價值。

關鍵詞：膿毒癥；預后；質子核磁共振；血清代謝組學

Construction of a predictive model of short-term death risk in patients with sepsis based on NMR metabolomics characteristics and its efficacy

ZHANG Hongyu， TANG Yongjun， REYIHANGULI Shataer， LONG Xiaoyan

Department of Intensive Care， The Second Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Urumqi 830000， China

Abstract： Objective To investigate the effect of building a predictive model of short-term mortality risk in sepsis patients based on NMR metabolomics characteristics. Methods Sixty patients with sepsis admitted to ICU of our hospital from January 2020 to December 2022 were selected as the study objects. All patients were divided into survival group and death group based on the survival status at 28 d after treatment. General data and laboratory examination data of patients were collected. Serum samples were collected for proton nuclear magnetic resonance specific metabolic markers when patients were enrolled. The top 4 products were selected by LASSO regression to construct a short-term death risk prediction model for sepsis patients. Finally， patients with sepsis treated in ICU of our hospital from January 2023 to December 2023 were included to verify the predictive effect of the model. Results APACHE II scores in the death group were higher than those in the survival group， and the difference was statistically significant （Plt;0.05）. Multivariate statistical analysis method shows that the prediction ability of the original model is greater than that of any one random arrangement of Y variables， which proves that the model is effective. The scatter plot of unsupervised PCA explained 57% of the variables （PC1=50%， PC2=7%）， and the metabolic profile was different between the control group and the model group， with significant changes in serum endogenous metabolites in sepsis patients after PCPA modeling. OPLS-DA graphical model has good fitting effect， there are no special points， and the distribution areas of the two groups are completely separated. As shown in the loading matrix， the levels of L-aspartate， indoleacetic acid and alanine increased， while the levels of isoleucine and leucine decreased. The top 50 variables with the largest VIP value in the OPLS?DA model were extracted for non-parametric test. Finally， 34 variables with statistical significance were obtained （Plt;0.05）， and a total of 19 characteristic metabolites were most likely to be associated with sepsis death. Serum phenylalanine， creatine， acetoacetic acid， glutamic acid， methionine， urea， lactic acid and trimethylamine oxide in death group were significantly higher than those in survival group （Plt;0.05）. The C-index of short-term death risk in sepsis patients was 0.993 （95%CI： 0.931-

0.999） in an eriograms of four highly correlated metabolites selected by LASSO. The Nomogram model was of certain value in predicting the short-term mortality risk of sepsis patients （AUC=0.993， 95% CI： 0.978-1.000， Plt;0.001）. The short-term mortality risk in model-validated sepsis patients with a Nomogram model （AUC=0.934， 95% CI： 0.863-1.000， Plt;0.001） was useful. The accuracy， sensitivity and specificity of the model to the training set were 96.66%， 94.11% and 97.60%， respectively. The accuracy， sensitivity and specificity of the model to the validation set were 90.62%， 88.23% and 91.48%， respectively. Conclusion The prediction model of short-term death risk in sepsis patients based on serum NMR metabolomic characteristics has a good value in predicting the 28 d death risk of sepsis patients.

Keywords： sepsis; prognosis; proton nuclear magnetic resonance; serum metabolomics

膿毒癥常見于嚴重感染引起的全身炎性反應綜合征所誘發的器官代謝障礙，是目前臨床上致死率排名靠前的疾病之一［1］。早期積極干預并采用相應的治療手段可以有效降低膿毒癥患者的死亡率，故精準評價膿毒癥患者預后有助于及時開展積極有效的治療措施，也是目前臨床研究的熱點［2］。目前除外常用的臨床檢驗指標或病情評分運用于評估膿毒癥患者病情及預后，但上述指標受限于特異度，導致臨床應用效果不理想。基于基因及人體代謝研究技術的進步，對于疾病的精準化評估、診斷及治療已經成為臨床研究中的常用方法，其中代謝組學通過精確評估反應組織及細胞代謝的過程，對膿毒癥誘發的器官功能障礙的病理、生理改變過程具有準確的反應［3］。核磁共振光譜學被用于監測代謝組學改變情況，并且針對不同類型的疾病所致的代謝改變具有較好的監測價值［4］。膿毒癥患者因炎性反應可以導致人體正常氨基酸代謝紊亂，且可能是導致疾病發展的重要因素，目前尚缺少代謝組學相關指標與患者預后的臨床分析［5］。本研究通過核磁共振光譜監測膿毒癥患者代謝組學變化情況，并基于上述指標構建膿毒血癥患者短期死亡風險的預測模型，旨在為臨床評估膿毒癥患者預后提供參考。

1" 資料與方法

1.1" 一般資料

將2020年1月～2022年12月于我院ICU收治的膿毒癥患者作為訓練集構建預測模型，將2023年1～12月期間于我院ICU收治的膿毒癥患者作為測試集驗證模型預測效果。納入標準：符合《中國嚴重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）》［6］對于膿毒癥的相關診斷標準；年齡≥18周歲；預計死亡時間≥72 h；臨床資料完整。排除標準：合并惡性腫瘤者；合并內分泌、自身免疫系統疾病及血液系統疾病患者；孕婦或哺乳期婦女；中途終止治療者；嚴重精神-神經系統疾病不能配合者；臨床資料不完整者。共計納入模型構建對象60例（訓練集），模型驗證對象49例（驗證集）。截止研究結束，模型構建對象的60例患者中28 d死亡17例，最終分組為存活（n=43）及死亡（n=17）；模型驗證對象49例中28 d死亡21例，最終分組為存活（n=28）和死亡（n=21）。本研究經我院倫理委員會審核批準（審批號：20191107230），患者簽署知情同意書。

1.2" 方法

所有患者均以進入ICU病房為觀察起點，以治療28 d為終點，根據患者28 d內存活情況，將患者分為死亡組及存活組，分別比較兩組患者一般資料及實驗室檢查資料。

1.3" 觀察指標

1.3.1" 一般資料" "包括年齡、性別、BMI、感染部位、合并基礎疾病、急性生理與慢性健康評分（APACHE II）及機械通氣比例。

1.3.2" 核磁共振代謝組學檢測方法" "所有患者均于入科后抽取空腹肘靜脈血5 mL，室溫下離心（3000 r/min，10 min）后收集血清置于EP管中，-80 ℃保存。檢測時取出血清樣本在室溫下解凍，取200 μL血清加入400 μL磷酸鹽生理鹽水緩沖液中，于室溫下放置10 min，4 ℃離心（10 000 r/min，10 min），取550 μL上清液移至5 mm核磁管中。將裝有血清的核磁管插入測試槽內，放入進樣口。應用核磁共振波譜儀（Inova 600型）CPMG脈沖序列[（RD-90°-（τ-180°-τ）n-ACQ）]對質子核磁共振（1H-NMR）譜圖進行檢測，1H-NMR核磁共振頻率為599.95 MHz，采樣數據點為32 k，譜寬10 000 Hz，采樣延遲2 s，采樣時間均為1.64 s，測試溫度為25 ℃。當檢測到1H-NMR譜后，調整葡萄糖峰及基線保存。所有1H-NMR譜都在同一波譜儀上獲得，選取質量較高的1H-NMR譜樣品進行二維核磁共振譜測試，包括1H-1H同核相關譜、質子全相關譜和J-分解譜等用于譜圖中的各峰的指認。用Topspin軟件對各組樣本1H-NMR譜進行基線及相位的調整，所有1H-NMR譜均由同一人處理完成。經過核磁共振篩選出代謝產物后，采用氨基酸含量檢測試劑盒（高效液相色譜法）對目標氨基酸含量進行檢測，試劑盒（上海酶聯生物科技有限公司）。

1.4" 統計學分析

所有數據均采用SPSS22.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。采用SIMCA-P+11軟件，對所測試的各組數據進行正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）分析和偏最小二乘方法分析（PLS-DA）。采用主成分分析（PCA）和PLS-DA比較死亡組與對照組間血清代謝物數據。使用Metabo Analyst 5.0軟件（https：//www.metaboanalyst.ca.）進行代謝物數據分析。通過OPLS-DA 獲得代謝物相關系數，并以此確定各組血清差異性代謝成分。應用最小絕對收縮和選擇算法（LASSO）回歸分析，選擇最佳Lambda值，納入4個預后相關代謝組學特征，構建預后風險評分模型。使用R3.6.1軟件根據核磁共振代謝產物構建膿毒癥患者短期死亡風險預測模型，通過 ROC 曲線評估預后模型的預測價值。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 一般資料比較

兩個分類的死亡組患者APACHE II評分高于存活組，差異有統計學意義（Plt;0.05）；兩組患者其他項目的差異無統計學意義（Pgt;0.05，表1）。

2.2" 模型構建患者1H-NMR特異性代謝標志物多元統計分析

模型驗證排列實驗（n=120）中下端任何1次隨機排列產生的R2、Q2均小于上端（R2Y=0.005，Q2=0.005），即原始模型的預測能力大于任何1次隨機排列Y變量的預測能力，證明模型有效。采用無監督的主成分分析，得分散點圖共解釋了57%的變量（PC1=50%，PC2=7%），膿毒癥患者經PCPA造模后血清中內源性代謝物發生了顯著變化（圖1）。

2.3" 模型構建患者特異性代謝標志物分析

采用OPLS-DA法對兩組樣本建模 ，以“死亡”為因變量（y），積分值為自變量（X），將y值設定為0/1的矩陣（存活患者設為0，死亡患者設為1），模型參數R2Y=0.005，Q2=0.005。模型擬合效果好，兩組的分布區域完全分開。對應的載荷矩陣圖顯示，L-天門冬氨酸、吲哚乙酸、丙氨酸等水平升高，異亮氨酸、亮氨酸等水平下降（圖2）。

2.4" 膿毒癥患者生物標志物的尋找

提取OPLS-DA模型中VIP值最大的前50個變量（VIP值gt;1.49）進行非參數檢驗，得到34個有統計學意義的變量（Plt;0.05）。綜合OPLS-DA 載荷矩陣圖、VIP值、非參數分析結果，選擇相關性排名前19個特征代謝物。比較兩組患者代謝產物具體情況，結果顯示：模型構建組死亡組患者血清苯丙氨酸、肌酸、乙酰乙酸、谷氨酸、蛋氨酸、尿素、乳酸及氧化三甲胺顯著高于存活組（Plt;0.05，表2，圖2～3）。

2.5" LASSO回歸篩選代謝產物

應用LASSO回歸對差異有統計學意義的19個血清代謝產物進行篩選，最終篩選出的4個代謝產物：苯丙氨酸、谷氨酸、蛋氨酸及氧化三甲胺，LASSO回歸的回歸迭代圖和系數壓縮圖（圖4）。

2.6" 基于核磁共振代謝產物構建的膿毒癥患者短期死亡風險模型效果分析

將LASSO篩選出的4個代謝產物建立列線圖預測模型預測膿毒癥患者短期死亡風險，列線圖模型膿毒癥患者短期死亡風險的C-index為0.993（95% CI： 0.931～0.999）（圖5A）。校準曲線顯示在訓練集中列線圖模型的預測概率與實際概率均具有良好的一致性（圖5B）。ROC曲線分析結果顯示：列線圖模型預測訓練集和驗證集患者的短期死亡風險均具有的一定價值（AUC=0.993、0.934，95%CI：0.978～1.000、0.863～1.000，Plt;0.001）。模型對訓練集預測準確率分別為96.66%，敏感度分別為94.11%，特異度分別為97.60%。模型對驗證集預測準確率分別為90.62%，敏感度分別為88.23%，特異度分別為91.48%（圖5C）。

3" 討論

既往研究指出，PCT、乳酸及白蛋白等實驗室檢查指標以及APACHE II、GSC、MEDS等綜合評價指標對于膿毒癥患者預后具有一定的預測價值，但仍無法解決膿毒癥患者死亡風險居高不下的情況［7-8］。雖然醫療水平有限是導致膿毒癥患者死亡的重要原因，但深入了解膿毒癥患者預后的危險因素能為降低死亡風險提供有意義的參考意見［9-10］。

代謝組學是對生物樣品中各小分子代謝物進行系統鑒定和定量分析，通過檢測代謝途徑末端的內源性分子化合物，反映身體狀態變化情況，從而提供一種識別潛在生物標志物的新型檢測方法，為繼基因組學、轉錄組學之后迅速發展的新型檢測手段，目前，代謝組學已被廣泛應用于研究膿毒癥的病理機制和生物標志物［11-12］。1H-NMR因其具有采集時間短、樣本保存容易及可高度重復性等原因而備受重視［13］。通過1H-NMR對患者血標本進行檢測，共分析出19個差異產物。其中上調的標志物中吲哚乙酸已經被證實與膿毒癥死亡風險有一定關系［14］，肌酸、肌酐、尿素氮及乳酸與膿毒癥之間的關系也得到了相應的證實［15-17］。下調的氨基酸中，除氧化三甲胺外，其余氨基酸均為人體代謝及營養所需的重要組成部分［18-21］，而膿毒癥患者出現營養不良的風險較高，故上述氨基酸因營養不良導致以上幾個氨基酸的含量顯著下降。

后續在1H-NMR結果的基礎上，本研究通過篩選的19個差異產物進行LASSO回歸后共篩選出4個相關系數較高的產物。有研究指出，苯丙氨酸屬于芳香族氨基酸，其可以與支鏈氨基酸競爭，穿透血腦屏障后導致假神經遞質的形成，從而抑制神經系統的正常功能［22］。也有研究指出，苯丙氨酸在膿毒癥所致的急性腎損傷時也會有濃度升高的情況［23］。以上分析說明苯丙氨酸高濃度狀態說明膿毒癥可能已經導致神經系統及腎損傷的發生，故其濃度升高說明患者損傷更重，預后相對較差，本研究中患者苯丙氨酸濃度顯著升高，與既往研究結果類似。谷氨酸是體內氮代謝的基本氨基酸，其也具有參與神經內信息傳遞的遞質作用［24］。有研究指出，谷氨酸濃度過高會導致神經系統活動過于頻繁，從而導致神經系統損傷加劇［25］。也有研究指出，活化的中性粒細胞會發生谷氨酸自分泌的情況，會導致局部氧自由基大量生成，從而導致炎性反應加劇的情況［26］。本研究顯示，1H-NMR指出谷氨酸上調與膿毒癥28 d死亡相關，通過測量也得出了相同的結果，說明此項指標與膿毒癥預后相關性較高。蛋氨酸又稱甲硫氨酸，是體內多個代謝的重要基礎，其代謝產物有S-腺苷甲硫氨酸以及S-腺苷同型半胱氨酸，其中前者可以作為反甲基化反應的甲基供體，而后者則是同型半胱氨酸的前體，二者均與腎功能具有顯著的相關性［27-28］。本研究顯示，蛋氨酸表達升高是影響膿毒癥28 d死亡的重要因素，這與上述既往研究結果類似。同時蛋氨酸可以通過促進PRMT2的表達從而增加 TLR4/IRF3 信號通路活化進而加劇IFN-β的產生，而IFN-β已經被證實是引起膿毒癥休克的關鍵因素［29-30］。氧化三甲胺是由腸道菌群代謝過程中產生的重要因素，研究顯示其含量升高與血栓形成風險呈正相關[31]，同時也意味著腸道屏障功能受損［32］。故氧化三甲胺含量升高與膿毒癥患者28 d死亡風險正相關，本研究結果與之類似。可以認為膿毒癥隨著病情的加重，腸道以及凝血功能障礙逐漸加重，導致氧化三甲胺明顯升高，后續會因為腸道屏障及凝血功能障礙發更嚴重的炎癥風暴或DIC的發生，導致患者死亡［33］。基于上述4個指標建立的列線圖模型對于本次研究中的膿毒癥患者28 d死亡風險的預測效果也較好，準確率、敏感度及特異度均超過90%。最后將模型應用于驗證患者，雖然準確率、敏感度及特異度均不同程度下降，但仍在90%左右，說明本次構建的模型具有較好的臨床應用價值。

本研究通過1H-NMR對患者血標本進行檢測，具有差異的產物數量多于高效液相色譜法，同時測試集患者的準確率、敏感度及特異度均有一定下降。出現上述情況的原因可能有以下幾點：檢測方式的差異；樣本量較小導致偏倚；檢測標本不夠全面。故為進一步解決上述問題，后續會進一步擴大樣本量，同時選擇更加豐富的標本種類進一步了解膿毒癥對于人體代謝的影響，從而建立更加可靠及完善的模型。

綜上，基于血清核磁共振代謝組學特征構建膿毒癥患者短期死亡風險的預測模型對于膿毒癥患者28 d死亡風險具有較好的預測價值，可以作為下一步研究的方向進行探索。

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（編輯：林" 萍）