超聲引導復合式冷熱消融系統治療Hepa1-6瘤鼠的療效及免疫效應

摘要：目的" 探討超聲引導復合式冷熱消融系統治療Hepa1-6瘤鼠的療效及免疫效應。方法" 選取健康C57BL/6J小鼠建立肝癌Hepa1-6小鼠移植瘤模型。將40只Hepa1-6荷瘤小鼠隨機分為4組：空白對照組、假手術組、外科手術組及復合式冷熱消融治療組，10只/組。分別于治療前及治療后1、2、3、4周，采用超聲評估各治療組荷瘤小鼠皮下腫瘤體積變化，采用血流式細胞術檢測檢查各組小鼠外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞數百分比。于治療2周后隨機處死各治療組小鼠各3只，并對治療后病灶行HE染色病理檢查及免疫組化檢測組織CD4+、CD8+細胞光密度值。結果" 空白對照組及假手術組各時間點的腫瘤組織逐漸增大，但兩者差異無統計學意義（Pgt;0.05）；與空白對照組及假手術組相比，復合式冷熱消融組腫瘤體積在治療后各時間點腫瘤逐漸縮小，差異有統計學意義（Plt;0.05）。復合式冷熱消融治療組術后與術前比較，術后各時間點血清CD4+T、CD8+T細胞水平均升高，明顯高于空白對照組、假手術組、外科手術組（Plt;0.05）。冷凍治療組血清CD4+T、CD8+T細胞水平在治療后3周出現峰值，隨后出現下降。與對照組及假手術組相比，冷凍治療組在治療后2周腫瘤組織CD4+、CD8+細胞明顯增多，差異有統計學意義（Plt;0.05）。結論" 超聲引導復合式冷熱消融系統治療Hepa1-6瘤鼠具有很好的治療療效，同時還能夠激活免疫系統，增強機體的抗腫瘤免疫效應。

關鍵詞：超聲引導；復合式冷熱消融系統；Hepa1-6瘤鼠；療效；免疫效應

Experimental study on the therapeutic effect and immune response of Ultrasound-Guided Co-Ablation System in the treatment of Hepa1-6 tumor-bearing mice

CHEN Shaohua， Lü Guorong， XU Ziwei， LI Boyi

Department of Ultrasound Medicine， The Second Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000， China

Abstract： Objective To evaluate the therapeutic efficacy and immunological impact of an ultrasound-guided combined cryoablation and thermal ablation system （Co-Ablation System） in the management of Hepa1-6 tumor-bearing mice. Methods A hepatoma mouse model was established using healthy C57BL/6J mice inoculated with Hepa1-6 tumor cells. Forty tumor-bearing mice were randomly assigned to four groups： a blank control group， a sham operation group， a surgical operation group， and a Co-Ablation System group， with ten mice per group. Utilizing ultrasound， tumor volume alterations were assessed pre-treatment and at 1， 2， 3， and 4 weeks post-treatment. Flow cytometry was employed to quantify the percentages of CD4+ and CD8+ T lymphocytes in peripheral blood samples. Additionally， three mice from each group were euthanized two weeks post-treatment for histological analysis via HE staining and immunohistochemistry to determine the optical density of CD4+ and CD8+ cells. Results The tumor tissues in both the blank control group and the sham operation group exhibited gradual growth at each time point， with no statistically significant difference observed between the two groups （Pgt;0.05）. In contrast， the tumor volume in the Co-Ablation System group progressively decreased post-treatment， showcasing a statistically significant difference compared to the blank control and sham operation groups （Plt;0.05）. Notably， the serum levels of CD4+T and CD8+T cells in the Co-Ablation System group were markedly elevated compared to the blank control， sham operation， and surgical operation groups at all post-operative time points （Plt;0.05）. These levels peaked three weeks after treatment in the Co-Ablation System group， subsequently declining. Additionally， a significant increase in CD4 and CD8 positive cells within tumor tissue was observed in the Co-Ablation System group two weeks post-treatment， as compared to the blank control and sham operation groups， with the difference being statistically significant （Plt;0.05）.Conclusion The utilization of the Ultrasound-guided Co-Ablation System has proven to be highly effective in treating Hepa1-6 tumor mice， not only reducing tumor burden but also activating the immune system and potentiating the body's anti-tumor immune response.

Keywords： ultrasound guidance; Co-Ablation System; Hepa1-6 tumor-bearing mice; therapeutic effect; immune response

原發性肝癌是全球腫瘤相關死亡第2位的惡性腫瘤［1-2］ 。手術治療或肝移植曾是唯一可以治愈的手段，然而肝癌的手術切除率僅20%～30%［3-4］ 。除了手術和肝移植之外，消融技術是最有希望達到肝臟惡性腫瘤根治目的治療方法［5］ 。冷凍消融是一種目前臨床上常用的消融治療方式，被廣泛應用于多種實體腫瘤的治療［6-9］ 。復合式冷熱消融系統作為我國自主研發的一種先進腫瘤微創醫療設備，采用以深低溫冷凍與高強度加熱相結合的復合式模式治療腫瘤［10］ 。雖然復合式冷熱消融系統近幾年已廣泛應用于肺癌、肝癌等實體腫瘤的治療，并且臨床療效和安全性也得到了驗證［10-12］ ，但是目前關于復合式冷熱消融系統的療效及免疫效應的基礎研究仍未見報道。本研究通過探討超聲引導復合式冷熱消融系統治療肝癌動物模型的療效及免疫效應，旨在為復合式冷熱消融系統的臨床應用提供參考。

1" 材料與方法

1.1" Hepa1-6瘤鼠動物模型的建立［13］

選取健康SPF級近交C57BL/6純系小鼠，雄性，體質量20～30 g。小鼠適應性飼養3 d后用于種瘤。取對數生長期的Hepa1-6細胞，消化后用PBS稀釋成1×107 mL/L的細胞懸液，接種于小鼠右大腿皮下，每只接種體積為0.2 mL。當超聲檢查接種小鼠皮下結節最大直徑達10～20 mm時即造模完成。本研究動物實驗經福建醫科大學附屬第二醫院倫理委員會批準，審批號：[2020]福醫附二倫理審字（506）號。

1.2" "研究方法

1.2.1" 儀器與設備" "冷凍消融設備采用復合式冷熱消融系統（北京海杰亞醫療器械有限公司），以液氮為冷媒，最低冷凍溫度可達-196 ℃，應用無水乙醇為熱媒，可在冷凍結束后加熱消融針至80 ℃。本次實驗使用全部冷凍刀頭直徑均為2.0 mm。影像學引導設備采用GE E9彩色多普勒診斷儀，探頭為線陣探頭，頻率5～10 MHz。

1.2.2" 治療方法與步驟" "選取40只種植Hepa1-6肝癌細胞的荷瘤小鼠隨機分為空白對照組、假手術組、手術切除組和復合式冷熱消融治療組，10只/組。腫瘤生長過程中，定時觀察小鼠皮下肝癌腫瘤的成瘤及生長情況，使用彩超檢查測量并記錄腫瘤的長徑值（a）、寬徑值（b）及高徑值（c），根據各個徑向測量值計算腫瘤體積即V=a×b×c/2。

空白對照組：荷瘤小鼠未做任何特殊處理。

假手術組：荷瘤小鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉1 mg/kg麻醉后，固定備皮后，于腫瘤處行常規消毒、鋪巾，沿腫瘤長軸切開皮膚，分離腫瘤，直視下將直徑2.0 mm的復合式冷熱消融系統冷凍探針刺入腫瘤組織內中央。未啟動復合式冷熱消融系統設備，常規消毒，縫合皮膚，注意保暖，術后正常飼喂。

外科手術組：于荷瘤小鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉1 mg/kg麻醉后。仰臥固定于操作臺上。背部處沿腫瘤長軸切開皮膚，分離和完整切除腫瘤，徹底止血，縫合皮膚切口，術后正常飼喂。

復合式冷熱消融治療組：于荷瘤小鼠腹腔注射2%的戊巴比妥鈉1 mg/kg麻醉后，仰臥固定于操作臺上。背部皮膚處常規消毒、鋪巾，在瘤旁切一小口，使用復合式冷熱消融系統配備2 mm探針在超聲引導下經皮沿腫瘤長軸植入（圖1），針尖抵達腫瘤對側邊緣，首先導入冷媒氮氣，探針治療區在50 s內迅速使局部溫度降至-196 ℃以下，持續5 min，關閉氮氣并導入熱媒無水乙醇，使探針的溫度迅速恢復至80 ℃，一個冷熱循環治療過程結束。兩個循環后拔出探針，常規消毒，縫合皮膚，注意保暖，術后正常飼喂。

1.3" 觀察指標

1.3.1" 療效" "消融后1、2、3、4周應用超聲評估進行評估，分別測量腫瘤的長徑值（a）、寬徑值（b）及高徑值（c），按V=a×b×c/2計算腫瘤體積并記錄。

1.3.2" 免疫功能" "分別于消融前1 d及消融后1、2、3、4周抽取各組小鼠外周靜脈血置于抗凝管，以流式細胞儀（Beckman Couter）檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞百分比。

1.3.3" 病理檢查及組織免疫組化檢查" "治療后2周后隨機選取各治療組小鼠各3只，采用經皮往小鼠心臟注入1～2 mL空氣方法處死實驗動物，沿瘤體邊緣切開皮膚，手術治療組未見腫瘤組織，其余各治療組均完整挖出治療后腫瘤，標本石蠟包埋行6 μm連續切片，常規HE染色觀察腫瘤壞死情況，同時行組織免疫組化檢測組織CD4+、CD8+細胞光密度。

1.4" 統計學分析

應用SPSS21.0軟件進行統計學分析。所有計量資料均以均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD方法；方差不齊時采用Welch檢驗校正。以Plt;0.05為差異有統計學意義。

2" 結果

2.1" 術后病理

治療前：視野內部分腫瘤細胞水腫，細胞腫脹，胞質呈空泡化；細胞核形態較規則，異型性較低，核分裂象少見；組織可見少量炎癥細胞浸潤（圖2A）。

復合式冷熱消融治療后：視野內大面積腫瘤細胞壞死，胞漿紅染，胞核固縮深染或者消失；細胞核形態較規則，異型性較低，核分裂象罕見，壞死區可見大量炎癥細胞浸潤（圖2B）。

2.2" 療效評估

空白對照組、假手術組、外科手術組及復合式冷熱消融治療組治療前腫瘤大小差異無統計學意義（Pgt;0.05），空白對照組及假手術組的腫瘤組織逐漸增大，術后第4周空白對照組腫瘤體積達到2.747±0.176 cm3，假手術組達到2.847±0.213 cm3，兩組各時間點腫瘤大小差異無統計學意義（Pgt;0.05）；外科手術組在切除后2周內未發現新生腫瘤，在治療后3周出現新生腫瘤，第4周明顯增大。復合式冷熱消融組腫瘤體積在冷凍治療后腫瘤逐漸縮小，術后第4周縮小至0.0427±0.081 cm3，各時間點與空白對照組及假手術組相比，差異有統計學意義（Plt;0.05，表1）。

2.3" 免疫效應

2.3.1" 不同治療組不同治療時間點外周血清CD4+T、CD8+T細胞水平變化" "術前空白對照組、假手術組、外科手術組、復合式冷熱消融治療組間比較，血清CD4+T、CD8+T細胞水平差異無統計學意義（Pgt;0.05）。空白對照組及假手術組隨著時間推移，血清CD4+T、CD8+T細胞水平呈逐漸下降，各時間點之間的差異有統計學意義（Plt;0.05）。手術切除組術后與術前比較，術后各時間點血清CD4+T、CD8+T細胞水平差異無統計學意義（Pgt;0.05）。復合式冷熱消融治療組術后與術前比較，術后各時間點血清CD4+T、CD8+T細胞水平均明顯升高，均高于空白對照組、假手術組、外科手術組。復合式冷熱消融治療組組血清CD4+T、CD8+T細胞水平在治療后3周出現峰值，隨后出現下降（表2～3）。

2.3.2" 腫瘤組織免疫組化CD4+、CD8+細胞水平" 與對照組及假手術組相比，復合式冷熱消融治療組在治療后2周腫瘤組織CD4、CD8陽性細胞增多，差異有統計學意義（Plt;0.05，表4）。

3" 討論

冷凍消融術是運用廣泛的腫瘤微創手段，局部消瘤作用確切、不良反應小、安全性高［14］ 。氬氦刀是目前臨床上最常用的冷凍消融設備，它以氬氣為冷媒，氦氣為熱媒，冷凍溫度140～180 ℃，復溫溫度約30 ℃［15］ 。我國自主研發的復合式冷熱消融系統采用液氮為冷媒，易獲取，最低冷凍溫度可達-196 ℃，單針消融范圍更大；應用無水乙醇為熱媒，可在冷凍結束后加熱消融針至80 ℃，更快速溶解冰球，同時可消融穿刺針道、減少出血、預防腫瘤針道種植轉移，安全性更高［11］ 。另外，氬氦刀所采用的氬氣和氦氣價格昂貴，而復合式冷熱消融系統采用的氮氣及無水乙醇成本低廉，這有助于該技術的推廣應用。目前關于復合式冷熱消融系統治療療效及免疫效應的基礎研究仍較為缺乏。本研究通過對復合式冷熱消融系統在治療Hepa1-6肝癌荷瘤小鼠動物模型的療效及相關免疫效應的研究，對于指導臨床診療具有重要意義。

相對于傳統氬氦刀冷凍系統，復合式冷熱消融系統具有更低的消融溫度（-196℃），由于冷凍消融致腫瘤細胞死亡的溫度為-40℃以下，冷凍溫度越低，所產生冰球范圍越大，消融范圍越大，殺滅腫瘤細胞就更徹底［16］ 。另外，與氬氦刀冷凍系統相比，該消融系統具有更高的復溫溫度（80℃），一方面可提高復溫的效率，減少手術時間及低溫并發癥，同時較高的復溫溫度可以有效發揮針道止血作用［17］ 。盡管有研究表明緩慢解凍比快速冷凍是更重要的細胞死亡機制［18］ ，但較高的復溫溫度可直接熱消融滅活腫瘤細胞，從而達到治療腫瘤的效果。本實驗研究中復合式冷熱消融治療組Hepa1-6荷瘤小鼠在治療后第4周皮下腫瘤體積從1.234±0.088 cm3縮小至0.0427±0.081 cm3，表明復合式冷熱消融系統其冷熱復合消融機制在治療Hepa1-6荷瘤小鼠皮下腫瘤具有很好的療效。

與手術、放療、熱消融相比，冷消融能夠最大程度地保留瘤灶抗原活性，從而更有效地激發抗腫瘤免疫反應，這對于晚期癌癥的治療極其重要［14］ 。但是，有研究表明不同腫瘤對于冷凍治療的免疫應答不完全相同，這可能與腫瘤異質性有很大關系［19-20］ 。有研究認為［21］ ，與射頻消融或微波消融相比，肝臟腫瘤冷凍消融的意義有限，因此研究相對較少。而且目前的研究結果對于冷凍消融治療肝臟腫瘤的免疫效應仍存在爭議［22-24］ 。本研究結果顯示在采用復合式冷熱消融后荷瘤小鼠的外周血及組織內CD4+、CD8+T淋巴細胞比例均升高，表明復合式冷熱消融后小鼠免疫效能有明顯提升，進一步證實高低溫多模態消融技術具有很強的機體免疫反應誘導能力。究其原因：首先，高低溫多模態治療后增強T效應細胞（CD4+和 CD8+T）活化［25］ ；其次，該方法可增加細胞毒T細胞浸潤，誘導免疫細胞進入腫瘤碎片［26］ ；再者，其可誘導急性IL-6在啟動級聯先天性和適應性抗腫瘤免疫應答中起重要作用，導致CD4+T細胞分化［27］ 。有研究表明，組織壞死與凋亡面積的比例是決定免疫狀態的關鍵因素［28］ ，壞死誘導免疫增強，凋亡導致免疫抑制，壞死、凋亡之間的平衡是調控免疫效應的關鍵因素，高冷凍速率導致細胞以壞死為主，從而激活免疫反應，而低冷凍速率則導致細胞以凋亡為主，從而出現免疫抑制［14］ 。相較于氬氦刀冷凍消融系統，本研究采用的復合式冷熱消融系統具有更低的消融溫度，更高的冷凍速率，有助于細胞組織壞死的產生，進而增強免疫反應［29-30］ 。

本研究結果顯示，對照組及假手術組荷瘤小鼠外周血清CD4+、CD8+T細胞比例隨著時間推移呈下降趨勢，表明腫瘤對于荷瘤小鼠具有免疫抑制作用，這與既往研究[31]一致。另外，復合式冷熱消融后荷瘤小鼠外周血清CD4+及CD8+T細胞比例在治療3周后出現了下降，這說明消融治療可以啟動荷瘤小鼠的免疫反應但并不會使免疫水平一直升高，而具體原因仍有待進一步研究。雖然本研究通過實驗證實新型復合式冷熱消融系統具有良好的治療腫瘤療效及免疫效應，但是仍存在一些不足：本研究缺乏傳統氬氦刀治療組作為對照，無法通過客觀對比兩者在療效及免疫效應方面的區別；本研究僅從常規超聲監測腫瘤體積變化作為治療療效評估，缺乏造影手術評估腫瘤活性及其滅活范圍情況；本研究樣本量較小、研究時間較短，需要進一步擴大樣本量和延長研究時間，以進一步驗證研究結果。

綜上，本研究表明超聲引導復合式冷熱消融系統治療Hepa1-6瘤鼠具有較好的治療療效，同時，還能夠激活免疫系統，增強機體的抗腫瘤能力。這為復合式冷熱消融系統在臨床上的應用提供了科學依據，為肝腫瘤患者的治療提供了新的選擇。

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（編輯：熊一凡）