一步式農藥殘留快速檢測集成卡制備及應用

關鍵詞：農藥殘留；快速檢測；檢測卡；有機磷；氨基甲酸酯；膽堿酯酶抑制法

0 引言

農藥殘留問題已成為影響我國農產品質量安全的重要因素之一。有機磷（OP）和氨基甲酸酯（CM）類農藥在我國農業生產中使用最為普遍（占70%～75%），其通過不可逆的抑制動物神經系統的乙酰膽堿酯酶（AchE），實現對昆蟲的殺傷[1-3]。質譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法等方法在果蔬農藥殘留檢測中應用較廣，但這些方法需要昂貴的儀器和專業的操作人員，并且耗時[4-7]。膽堿酯酶抑制法具有成本低、耗時短、操作簡單等優勢，是國家標準GB/T5009.199—2003《蔬菜中有機磷和氨基甲酸醋類農藥殘留量的快速檢測》規定的對OP和CM類農藥殘留進行快速篩查的通用方法[8-9]。目前，這種方法仍然受到多步驟操作、酶活性不穩定等因素的限制。因此，研究開發性能穩定、靈敏度高的新型農藥殘留即時檢驗（POCT）系統，具有十分重要的意義。

噴墨打印技術以非接觸的方式簡單、準確地將微量材料沉積到印刷基材上，具有穩定性好、準確度高、重現性好及成本效益高等優點[10-12]。它可以通過噴墨打印的方式實現多種材料，如小分子、生物蛋白和藥物等的固定[13-15]。GDORE等[16]使用噴墨打印機打印多酶二維陣列，并檢測了固定后酶活性。LEEJ等[17]制備酶溶液作為打印墨水，固定黃嘌呤氧化酶并評估藥物活性。但考慮到農藥對乙酰膽堿酯酶的抑制需要時間，實現農藥殘留一步法檢測的研究較少。

本研究基于膽堿酯酶抑制法，利用數字化控制的高精度樣品沉積技術——噴墨打印技術，構建了有機磷和氨基甲酸酯類農藥殘留廣譜、快速篩查的新型檢測方法。利用噴墨打印技術，將反應體系打印到聚乙烯醇（PVA）膜上，反面貼上AChE酶膜片，以聚氯乙烯（PVC）膠板做支撐將所有成分壓制成一個整體，制備靈敏、高效、方便操作并便于攜帶的檢測集成卡，建立了一種簡單、快速、高效的農藥殘留檢測方法，簡化了檢測步驟，拓寬了檢測的應用范圍，提高了檢測的便捷性和有效性，實現了檢測過程的一步化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

氧化樂果和克百威等農藥標準品購自北京國家標準物質信息中心；AChE購自鄭州貝貝生物科技有限公司生產的紅林蟻膽堿酯酶；果蔬樣品購自鄭州市超市；碘化乙酰硫代膽堿（Atch-I）、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、PVA購自上海阿拉丁試劑有限公司；納米玻璃纖維膜、PVC膠板購自上海金生物科技有限公司。

MilliQ試劑水系統（Millipore，Billerica，MA）制備超純水；噴墨打印機為HPInkTankWireless418。

1.2 試驗方法

1.2.1 溶液配置

配制pH值為8.0的磷酸鹽（PS）緩沖溶液；取適量農藥標準品，用PS緩沖溶液稀釋至合適濃度；稱取Atch-I溶解于超純水中，制備不同濃度的底物溶液；稱取DNTB，分別溶于無水乙醇中，制備不同濃度的顯色劑溶液。

1.2.2 打印設置

將配置好的底物、顯色劑和PS緩沖溶液各取0.5mL分別注射進入清洗干凈的M（洋紅色）、C（青色）、Y（黃色）墨盒中，并使其均勻地吸附在墨盒中的海綿上，封閉墨盒，準備打印。試驗通過AdobePhotoShop軟件控制CMYK顏色參數，使相應墨盒中的墨水噴射出來。利用AdobePhotoShop軟件將CMYK顏色參數設置為C=100、M=0、Y=0、K=0時，則只有注入C墨盒中的墨水能噴出。同樣，通過調整參數，可以使其他相應墨盒中的墨水噴射出來。

1.2.3 打印層數優化

將0.5mL（濃度12.5mg/mL）和0.5mL（濃度125mg/mL）的底物打印溶液分別注入M墨盒中；將0.5mL（濃度10.5mg/mL）和0.5mL（濃度105mg/mL）的顯色劑打印溶液分別注入C墨盒中；將0.5mL（1×）和0.5mL（10×）的PS打印溶液分別注入Y墨盒中。通過AdobePhotoShop調節CMYK相應的參數，利用羊皮紙為打印基板來測試打印效果。分別打印M=100（C=Y=K=0）、C=100（M=Y=K=0）和Y=100（C=M=Y=0）的直徑6mm的圓形。低濃度的PS緩沖溶液（1×）、底物溶液（12.5mg/mL）和顯色劑溶液（10.5mg/mL）打印10層；高濃度的PS緩沖溶液（10×），底物溶液（125mg/mL）和顯色劑溶液（105mg/mL）打印1層。打印結束后，在各打印圖案上滴加酶抑制反應體系中沒有被打印在圖案中的其余反應溶液，室溫靜置2min，觀察各打印圖案上溶液的顯色情況，分析打印濃度與打印層數之間的關系。

1.2.4 打印溶液濃度優化

向噴墨打印機的M墨盒中注入0.5mL不同濃度的底物打印溶液（50、75、100和125mg/mL），向C墨盒中注入0.5mL不同濃度的顯色劑打印溶液（30、50、80和100mg/mL），向Y墨盒中注入0.5mL不同濃度的PS打印溶液（10×、20×、30×、40×），通過AdobePhotoShop調節CMYK相應的參數，在羊皮紙上測試打印效果。打印結束后，在打印圖案上滴加反應體系中沒有被打印在圖案上的成分，陰性對照為在各打印圖案上滴加等量的水，室溫靜置2min，觀察顯色情況，選擇底物、顯色劑、PS打印溶液打印1層即可顯色明顯的最佳顯色濃度。

1.2.5 農藥檢測

將OP農藥（氧化樂果）、CM類農藥（克百威）稀釋至不同濃度（氧化樂果0.5、1.0、2.0和3.0mg/L；克百威0.01、0.05和1.70mg/L），滴入檢測卡中，室溫放置15min后，觀察顯色結果。以超市購買的大白菜作為實際樣品，將不同濃度的氧化樂果（0.5、1.0、2.0和3.0mg/L）溶液噴灑于大白菜的葉片上，使葉片表面上的農藥量達到1mL/g，并將葉片在室溫下靜置24h。靜置結束后將葉片剪碎，稱取5g于燒杯中，并向燒杯中加入10mL、1×PS緩沖溶液，充分振蕩，靜置5min后吸取40μL上清液滴加于檢測系統的檢測點上，室溫靜置15min，觀察檢測點的顯色情況。

一步式快速檢測集成卡制備及農藥殘留檢測示意如圖1所示。

2 結果與分析

2.1 打印層數與打印濃度選擇

由圖2可知，低濃度溶液在打印基板上沉積10層后的顯色效果與高濃度溶液在打印基板上沉積1層后的顯色效果相同，說明打印層數的疊加也是打印濃度疊加的過程。為了使檢測系統的制備過程更加高效、快捷，試驗將確定底物、顯色劑、PS打印溶液在利用噴墨打印技術打印時打印1層就可以顯色明顯的打印濃度。

2.2 底物打印濃度選擇

由圖3可知，隨著打印濃度增加，顯色效果逐漸增強，當底物打印溶液濃度125mg/mL時，顯色效果最強，因此，確定底物打印溶液濃度125mg/mL。

2.3 PS打印溶液打印濃度選擇

由圖4可知，不同濃度的PS打印溶液在打印基板上沉積1層后的顯色效果無差異，因此，試驗選擇10×的PS打印溶液來進行后續的打印。

2.4 顯色劑打印溶液打印濃度選擇

由圖5可知，隨著打印濃度增加，顯色效果逐漸增強，當顯色劑打印溶液濃度105mg/mL時，顯色效果較強，因此，確定顯色劑打印溶液濃度105mg/mL。

2.5 農藥殘留檢測集成卡對常見農藥檢測靈敏度

為了評估農藥殘留檢測系統對常見OP和CM類農藥檢測時靈敏度，試驗選取了OP和CM類代表農藥氧化樂果、克百威，進行檢出限（LOD）測定，檢測結果如圖6和表1所示。國家標準規定的氧化樂果、克百威LOD分別為2.3和0.5mg/L，試驗所測LOD分別為0.5和0.01mg/L[18]。檢出限均滿足國家標準的檢出限標準，并且其檢出限在一定程度上優于國家標準的檢出限標準，說明制備的農藥殘留檢測系統具有較高的靈敏度。

2.6 農藥殘留檢測集成卡對實際樣品中農藥殘留定性檢測

為了進一步評估農藥殘留檢測系統對實際樣品中存在的農藥殘留情況進行檢測時檢測效果，選用超市購買的大白菜作為實際樣品，并將氧化樂果標準品用PS緩沖溶液稀釋成合適的濃度用于檢測，檢測結果如圖7所示。由圖7可知，農藥殘留檢測系統可以檢測到實際樣品中的氧化樂果，并且檢測系統對氧化樂果檢出限1mg/mL，優于國家標準的氧化樂果檢出限濃度（2.3mg/mL）。

2.7 農藥殘留檢測集成卡與市售檢測試劑盒對比

利用本研究制備的農藥殘留檢測卡、市售農藥殘留檢測試劑盒（分光光度法），分別對常見OP和CM類農藥進行檢測，結果如表2所示。本研究制備的一步檢測卡對幾種農藥的IC50檢出值均低于市售農藥殘留檢測試劑盒，表明本研究系統具有更低的檢出濃度，更高的靈敏度。

3 結束語

本研究采用噴墨打印技術沉積反應體系，制備了簡單、快速、穩定的一步式OP和CM類農藥殘留快速檢測集成卡。制備的新型農藥殘留POCT系統與傳統的依賴分光光度計的檢測方法相比，實現了由濕式、多步式的檢測方式變為干式、一步式檢測。當檢測樣品滴加到酶膜上時，通過顏色的變化即可判斷出被檢樣品中的農藥殘留情況。該檢測卡取代了傳統的用移液槍滴加的步驟，簡化了操作程序，實現了納升級溶液的精確自動化輸送，提高了檢測靈敏度。同時，沉積在計算機控制條件下進行，大大提高了檢測系統的再現性，減少了檢測點之間的誤差。對納升級溶液代表性農藥進行檢測，結果表明，快速檢測集成卡對這幾種農藥的檢出限符合國家標準規定的檢出限，在一定程度上比市售檢測試劑盒的檢出限更低，具有較高的靈敏度。新型農藥殘留快速檢測集成卡操作簡便、方便快捷、易于使用及價格合理，具有靈敏度高、穩定性強、重現性好的優點，適合多種場合實時檢測，在POCT中表現出較大的應用潛力。