核酸適配體傳感器在常見食源性致病菌檢測中的應用及發展

關鍵詞：食源性致病菌；快速檢測；核酸適配體；適配體篩選；核酸適配體傳感器

0 引言

食源性致病菌是一類通過食物進行傳播的致病菌，人體一旦被食源性致病菌侵染，極易導致急性腸胃炎、腹瀉、頭痛、嘔吐甚至死亡事件[1]。較為常見的食源性致病菌，主要有大腸埃希氏菌、沙門氏菌、志賀氏菌、單核細胞增生李斯特氏菌、副溶血性弧菌、溶血性鏈球菌和金黃色葡萄球菌等。早期實驗室檢測方法主要在分離、培養、鑒定等方面，難以滿足大量樣品快速檢測的需求，因此急需快速、準確的方法檢測食源性致病菌，以縮小其危害范圍。近年來，研究人員不斷探索食源性致病菌的檢測方法，其中基于核酸適配體的檢測方法成為熱門趨勢。本研究總結歸納核酸適配體的篩選程序及其優缺點，列舉核酸適配體傳感器在食源性致病菌檢測中的應用，分析其在應對樣品的快速高效檢測要求時的發展趨勢，為食品及農產品中食源性致病菌的快速檢測方法改進提供更多思路。

1 檢測方法

1.1 早期篩查方法

早期的食源性致病菌檢測方法需要經過人工分離和培養、生化鑒定等煩瑣步驟，存在檢驗周期長、靈敏度低、勞動強度大等問題，并極易出現假陰性，一旦遇到突發性公共衛生事件，便很難滿足及時、準確、靈敏性和特異性高的需求[2]。

1.2 快速檢測方法

為適應食源性致細菌的快速測定要求，免疫學檢測技術、分子生物學檢測技術、代謝組學檢測技術和生物傳感器檢測技術等多種檢測技術被綜合運用[3-4]。

1.2.1 免疫學檢測技術

免疫學檢測技術原理是通過抗原?抗體特異性結合，將致病菌的表面抗原及產生的一些毒素當作關鍵檢驗目標[5]。現有的免疫學檢測技術包含酶聯免疫吸附技術、免疫熒光標記技術等。免疫學檢測技術雖操作簡便、特異性強、樣品處理量大，但抗體制備成本高、周期長、難度大[6]。

1.2.2 分子生物學檢測技術

分子生物學檢測技術以核酸、蛋白、酶等類型的生物大分子作為研究目標， 包含聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術、等溫擴增技術、生物芯片技術和高通量測序技術等[7]。分子生物學技術特異性強、重復性好，但易出現假陽性。

1.2.3 代謝組學檢測技術

代謝組學檢測技術是基于微生物生長代謝，并監測其整個生長過程中的底物、代謝產物的變化特征，旨在分析給定樣品某一時刻細胞內外所有小分子代謝物的集合[8-9]。代謝組學檢測技術在食品科學中剛剛興起，在把控原料和成品質量、生產和安全方面作用較大[10]。

1.2.4 生物傳感器檢測技術

生物傳感器是一種新型裝置，它包含一個生物受體，可以專門識別和捕獲目標分析物，一個物理或化學換能器，可將生物或化學反應轉換為可量化和可分析的信號[11]。其工作原理是生物受體與待測目標物發生反應生成信號，經由能量轉換器轉化成可量化分析的光、電等信號，再將其信號放大輸出，從而獲得目標分析物的數據信息。生物傳感器包含光學生物傳感器、表面等離子體共振生物傳感器、微生物代謝生物傳感器、壓電生物傳感器、細胞生物傳感器、電化學生物傳感器、免疫傳感器、核酸生物傳感器、阻抗和電導生物傳感器等[12]。生物傳感器檢測技術特異性和靈敏度高，但制作周期長，受樣品基質的影響較大，故需進一步改進[13]。

1.2.5 核酸適配體檢測技術

核酸適配體是單鏈的DNA 或者RNA 配體，它可通過指數富集的配體系統進化技術（以下簡稱SELEX技術）來完成篩選，核酸適配體具有內部結構靈活性、親和力大、體量小、易修飾、反應速度快和熱穩定性高等優點[14]。這些優點使核酸適配體在病原體檢測和生物分子篩選等方面得到了廣泛應用[15]。

核酸適配體識別元件親和力較高、特異性強，是抗體的優質替代選擇，近年來，基于核酸適配體構建的生物傳感器越來越多地被開發使用在食物源致病菌檢測工作中。

2 核酸適配體篩選及核酸適配體傳感器應用

2.1 核酸適配體篩選技術

常規SELEX 技術由多個循環組成，包括4 個階段：①體外合成DNA 或RNA 文庫；②與目標孵育；③分離未連接的核酸序列，并使用目標分子的溶液去除未結合部分；④PCR 擴增結合序列[16]。然而常規SELEX技術獲得的核酸適配體存在序列長、親和力低的問題，需經進一步優化才能實際應用。

為使核酸適配體能更有效地被應用在檢測中，研究人員針對食源性致病菌的SELEX 技術持續開發，其中包含Capture-SELEX、全細胞SELEX、氧化石墨烯SELEX、石英晶體微量天平SELEX、磁珠SELEX、毛細管電泳SELEX、微陣列芯片SELEX 和基因組SELEX 技術等[17]。

STOLTENBURG R 等[18] 研究了一種將靶標與磁珠結合來選擇熒光標記適配體的方法，推動了Capture-SELEX 技術發展。Capture-SELEX 技術是一種針對自然狀態靶點尤其是小分子靶點的技術，用于選擇針對小分子的 DNA 和 RNA 適配體，但易導致部分假陽性，降低篩選效率，增加篩選難度[19]。SUH S H 等[20] 使用全細胞SELEX 技術靶向不同生長階段的單核細胞增多性乳桿菌細胞，使用順序結合分析確定不同的靶結合位點，用共聚焦顯微鏡確認適配體與細胞表面的結合，篩選出4 個對李斯特氏菌具有高結合親和力的適配體。表1 列舉了各類細胞SELEX 技術優缺點[21]。SONGShixi 等[22] 采用功能化的氧化石墨烯和等溫滾環擴增開發了一種先進的細胞SELEX 技術，篩選針對食源性病原體副溶血性弧菌的適配體，獲得的適配體對副溶血性弧菌的親和力均gt;75%。WANG Lijun 等[23] 利用石英晶體微量天平篩選抗鼠傷寒沙門菌的適配體，篩選出的適配體具備較高的特異性和結合親和力，解離常數58.5 nM。HONG Shaoli 等[24] 利用磁性納米球（magnetic nanospheres，MNs）圖案化芯片開發了多功能篩選平臺，僅通過兩輪選擇就獲得了Kd 值22 nM 的特異性適配體。微流控細胞SELEX 技術的應用具有速度快、成本低、省力等優點，對適配體選擇的發展具有重要意義，然而微流控細胞SELEX 技術因獲得所需適配體的成功率低，未能在一般生物實驗室或臨床應用中得到廣泛利用。

2.2 核酸適配體傳感器在食源性致病菌檢測中應用

核酸適配體傳感器以適配體作為識別元件，用于識別目標物質，將識別結果轉化為可被測量的信號。其信號轉換可以是電化學、光學、溫度、壓電、磁和微機械或上述多種技術的組合[25]。

2.2.1 電化學適配體傳感器

電化學適配體傳感器是由換能元件（電極），將識別到的目標物在電極表面進行特異性雜交，然后將雜交的信息變為電信號輸出，并將其轉換成可測量信號[26]。PARK Y M 等[27] 采用軟/光刻和金屬蒸發的方法制備了納米柱電極，該電極高度有序并對食源性大腸桿菌O157∶H7 的擴增基因具有良好而穩定的電化學檢測性能。LUO Caihui 等[28] 將大腸桿菌O111 適配體固定在金電極上，通過金?硫醇結合將探針固定于電極表面上，研制了一種基于靶標誘導適配體置換的電化學生物傳感器， 可在3.5 h 內完成牛奶中大腸桿菌O111 的檢測。電化學生物傳感器工作示意如圖1 所示[28]。

2.2.2 比色適配體傳感器

比色法因其變色明顯、讀取速度快等特點被廣泛應用于病原體檢測中[29]。TAROKH A 等[30] 研發了針對鼠傷寒沙門菌檢測的一種新式比色傳感器，傳感器采用石墨化碳納米片（g-C3N4）和氧化銅（Cu2O）納米晶體的復合材料制備，在15～150 000 CFU/mL 范圍內具有較好響應，檢出限15 CFU/mL。YANG Tao 等[31]利用功能化金納米顆粒和多壁碳納米管研制了一種搭載于智能手機的比色適配體傳感器，用于監測牛奶中的大腸桿菌O157∶H7；顯色結果可直接利用智能手機的比色裝置進行分析，傳感器重現性好，對其他細菌無交叉反應；純培養可檢出O157∶H7 大腸桿菌濃度8 430 CFU/mL，人為污染牛奶培養1 h 可檢出O157∶H7大腸桿菌濃度524 CFU/mL。

2.2.3 熒光適配體傳感器

熒光適配體傳感器以適配體為識別元件，以熒光分析方法為信號轉換方式，為目標物檢測提供了新方法[32]。WU Zhengzong [33] 利用鉑包覆金納米棒（AuNR@Pt）的多功能特性，開發了一種基于內濾效應和顏色變化策略的雙模適應性傳感器，并將其應用于副溶血性弧菌檢測，在50～10 000 000 CFU/mL 和100～1 000 000 CFU/mL 范圍內，副溶血性弧菌與熒光信號強度和顏色信號強度均呈現良好的線性關系。CHEN Min 等[34] 開發了一種磁性納米Fe3O4 修飾的氧化石墨烯（MNPs@GO）和適配體功能化上轉化納米顆粒（UCNPs）的方法來檢測金黃色葡萄球菌。當金黃色葡萄球菌出現時，MNPs@GO被裂解，氧化石墨烯沒有被磁分離，這致使熒光共振能量轉移，從適配體功能化的UCNP 供體到氧化石墨烯受體在547 nm 處的上轉化熒光強度降低，最小檢出濃度達13 CFU/mL。WUWei 等[35] 將帶有熒光標記的腸炎沙門氏菌的特異性適配體吸附到氧化石墨烯中，當存在腸炎沙門氏菌時，適配體自氧化石墨烯中釋放出來，從而顯著恢復熒光，該適配體傳感器可在30 min 內檢測到低至40 CFU/mL的腸炎沙門氏菌，能夠滿足多重檢測的要求。

2.2.4 表面等離子體共振適配體傳感器

表面等離子體共振（surface plasma resonance，SPR）傳感器的工作原理為病原體與金屬表面結合引起共振向波長更大處轉移，移動量的大小對應著結合的毒素或者病原體的濃度大小。開始研究人員將抗體固定在薄薄的金膜上，以捕獲各種病原體，在某些波長和近紅外區域，金屬中的電子云和光相互作用產生了強烈的共振[12]。由于適配體跟抗體相比具有更好的穩定性、特異性和更小尺寸，逐漸被應用到SPR 傳感器中。AHN J Y 等[36] 采用全菌SELEX 技術策略分離抗副溶血性弧菌的特異性ssDNA 適配體，通過鏈霉親和素偶聯方法連接生物素化的適配體，并對基于適配體的SPR 生物傳感器進行不同的測試，其制備的基于適配體的SPR 生物傳感器平臺具有較高的特異性，可以較好地區分副溶血性菌。LEI Pinhua 等[37] 將鏈霉親和素標記的適配體（SA-適配體）作為信號放大單元，并將改進的不對稱聚合酶鏈式反應（PCR）方法結合到SPR 傳感器芯片的表面。該傳感器高靈敏、選擇性好、穩定，在最佳條件下，其檢測下限為20 pM（對于合成目標序列）。目前SPR 傳感器已成功應用于沙門氏菌的檢測，最小檢出濃度可達60 CFU/mL。

2.2.5 化學發光適配體傳感器

化學發光法（chemiluminiscence，CL）是指在不使用外部光源或光學元件的情況下，由化學反應產生的發光。CL 法具有高靈敏度、檢出限小、線性動態范圍廣、成本低和快速等優點[38]。CUI Liwei 等[39] 研制了一種基于二茂鐵標記的分子信號適配體（FC-MBA）固態電化學發光（ECL）生物傳感器開關系統，用于李斯特氏菌的快速檢測。該傳感器由ECL 襯底和ECL 強度開關組成，將金納米顆粒（AuNPs）與Ru（II）三聯吡啶的絡合物修飾到金電極上形成電化學發光襯底，并用FC 標記的MBA 作為電化學發光強度開關。該方法檢出限5 CFU/mL，回收率98.1%～103.6%。

2.2.6 側向流傳感器

側向流動檢測作為一種觀察點檢測手段，因其低成本、易操作、反應快和需樣量少等優點受到廣泛關注。LU Chunxia 等[40] 建立了一種基于適配體的側向流動試驗條，用于同時檢測金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157∶H7 和鼠傷寒沙門氏菌，試驗采用三明治的形式，將與金納米顆粒結合的一級適配體作為信號探針，二級適配體包被的膜作為捕獲探針，在最佳試驗條件下，對鼠傷寒桿菌、大腸桿菌O157∶H7 和金黃色葡萄球菌的視覺最低檢出濃度分別為1 000、10 000 和10 000CFU/mL，所有的測量均可在10 min 內完成。RASTOGIS K 等[41] 開發了一種橫向流動試驗條帶法，能夠靈敏地檢測大腸桿菌O157∶H7 特異性DNA，用修飾的寡核苷酸結合金納米粒子制備探針，輔以信號放大方法，最小可檢測濃度可達0.4 nM。側向流動試驗條已成為食源性致病菌的熱門檢測手段。

2.2.7 SERS 技術傳感器

表面增強拉曼光譜（surface-enhanced ramanspectroscopy，SERS）技術利用分子振動產生的光譜來對目標物進行檢測，其對樣品不會產生實質性的影響，損害較小。CHENG Siyun 等[42] 基于SERS 技術，將小麥胚芽凝集素（Wheat germ agglutinin，WGA）修飾到Fe3O4@Au 磁性納米顆粒（MNPs）上，利用WGA 和核酸適體的雙重識別模式制備了可同時檢測兩種高致病菌金黃色葡萄球菌（S.aureus）和單核增生李斯特菌（L.mono）的傳感器。在15 min 內高效捕獲復雜樣品中的金黃色葡萄球菌和單乳桿菌，檢測靈敏度高達6 cells/mL。ZHAO Wenshi 等[43] 基于Fe3O4@Au 納米復合材料（NCs）的適配體（Apt）生物傳感器，用于對致病細菌的捕獲、SERS 技術檢測和光熱治療（PTT），優化后的Fe3O4@Au-Apt 適配體傳感器對金黃色葡萄球菌的最小檢出限25 CFU/mL，細胞捕獲效率（CCE）高達68%。

各類核酸適配體傳感器已經被大量應用于食源性致病菌的檢測中，不同的傳感器技術各有優缺點，表2列舉了常見食源性致病菌的檢測應用實例，可根據檢測樣品種類及試驗環境選擇最佳方法。

3 結束語

核酸適配體具有三維結構，可特異性地跟目標分子相結合，其在高溫下更穩定，可經過多種技術融合的SELEX 技術篩選，易進行化學修飾，以便用于體外檢測。核酸適配體可以結合多種靶標，并且具有高度的敏感性和特異性。目前，篩選出的核酸適配體種類繁多，沒有統一規范，核酸適配體傳感器難以批量生產，篩選出待測目標物普遍適用的核酸適配體可有效解決此類問題。核酸適配體傳感器融合了電化學、比色法、熒光和SERS 等多種技術，近年來對用于修飾適配體的新型納米材料及傳感器載體的研究逐漸深入，核酸適配體傳感器在向微流控、集成化、可視化和多重檢測方向發展，有些傳感器更是可與智能存儲設備如手機、U 盤、電腦等連接，可更直觀地反映樣品的檢測結果，克服了樣品基質及檢測環境對適配體的影響，使食源性致病菌的檢測更加方便、快捷、高效。