糖腎灌腸方聯合纈沙坦治療2型糖尿病腎病的效果及對大鼠腎臟組織TLR2和TLR4表達的影響

李 晶, 馮 濤, 陳 晨, 馬 麗

(新疆醫科大學附屬中醫醫院1內分泌科, 2普外二科, 烏魯木齊 830000)

2型糖尿病腎病為一種糖尿病微血管并發癥,2型糖尿病腎病患者體內存在一種持續性的微炎癥狀態[1]。微炎癥狀態與病原體感染有所區別,以全身循環低水平、持續性的炎癥因子水平升高為主要表現[2]。微炎癥狀態始于2型糖尿病腎病早期,其伴隨病情進展不斷加重,最終造成患者腎功能障礙及腎實質損傷。因此,對微炎癥狀態加以控制,為延緩糖尿病腎病疾病進展提供了新思路。目前,西醫多以降壓、降糖、降脂等方式對糖尿病腎病患者進行治療。而中醫則基于整體視角進行辨證施治,對2型糖尿病腎病具有獨特療效。中藥灌腸療法是基于中醫藥基本理念而形成的一類中國特色傳統外治法。作為一種經驗藥方,糖腎灌腸方在臨床上已被證明可明顯緩解糖尿病腎病患者肢體浮腫、腰膝酸困、面色晦暗、乏力、惡心等癥狀,從而提升其生活質量。纈沙坦是現階段臨床上用于控制2型糖尿病腎病患者血壓水平的一種常見藥物。基于此,本研究針對糖腎灌腸方聯合纈沙坦對2型糖尿病腎病的臨床療效及大鼠腎臟組織TLR2 和 TLR4表達的影響進行觀察,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選取SPF級8周齡SD雌性大鼠60只[來源:遼寧長生生物技術股份有限公司;動物許可證號:SCXK(遼)2020-0001],飼養于新疆維吾爾自治區中醫藥研究院。飼養條件[動物適應環境 7 d,自由飲水飲食,室溫(22±1)℃,濕度(40±10)%,光照周期 12 h/12 h],適應性喂養7 d后,將大鼠進行分組。本研究通過新疆醫科大學實驗動物倫理委員會審批(批號:IACUC-20201002-9)。

1.1.2 實驗試劑及儀器 水合氯醛(廠家:濟南嘉格生物科技有限公司)、鏈脲佐菌素(廠家:美國Sigma公司)、血糖儀及血糖試紙(廠家:美國強生)、-80℃冰箱(廠家:中國榮事達;型號:BCD-245F)、大鼠麻醉機(廠家:上海玉研科學儀器有限公司)、全自動生化分析儀(廠家:日本日立公司;型號:7080)、電子天平(廠家:德國Sartorius公司)、血液基因組柱式提取試劑盒(廠家:康為世紀生物科技有限公司);蘇木精-伊紅染色試劑 盒(廠家:北京索萊寶生物科技有限公司)。

1.1.3 藥物配置 糖腎灌腸方(新疆維吾爾自治區中醫藥研究院提供):生大黃30 g、煅牡蠣50 g、澤瀉30 g、丹參15 g、槐花30 g、黑順片15 g、黃芩30 g。總方200 g加入10倍量水煎煮濃縮至150 mL,灌腸給予0.13 mL/10 g/只。纈沙坦膠囊(廠家:北京諾華制藥有限公司;批準文號:國藥準字H20040217;規格:80 mg)。240 mg加入100 mL生理鹽水,配置成2.4 mg/mL,0.12 mg/10 g/只。

1.2 方法

1.2.1 分組 將60只SD雌性大鼠,隨機選取10只作為空白對照組,其余50只進行右側腎臟摘取手術,構建2 型糖尿病腎病大鼠模型,造模過程中死亡10只,將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、糖腎灌腸方干預組、纈沙坦干預組、纈沙坦+糖腎灌腸方干預組,并對糖腎灌腸方干預組采用糖腎灌腸方治療,對纈沙坦干預組采用纈沙坦治療,對纈沙坦+糖腎灌腸方干預組采用糖腎灌腸方聯合纈沙坦治療。

1.2.2 右腎摘除 (1)用麻醉機麻醉大鼠并仰臥固定放置;(2)備皮,靠右側開口;(3)游離大鼠右腎,結扎血管,輸尿管,摘除右腎;(4)逐層縫合,碘伏消毒后,將大鼠放回籠中,術后觀察1周 。右腎摘除手術過程,見圖1。

圖1 右腎摘除術手術過程

1.2.3 構建2型糖尿病腎病模型 (1)構建2型糖尿病大鼠模型:腎摘除模型造模成功后,大鼠高糖高脂喂養30 d后,禁食24 h,精確稱量體重,按照40 mg/kg的劑量予大鼠腹腔注射1%鏈脲佐菌素(Streptozocin,STZ)溶液,連續注射3 d。注射72 h后,剪掉大鼠尾部尖端少許,用血糖儀測量大鼠血糖,血糖高于16.7 mmol/L視為造模成功;(2)構建2 型糖尿病腎病模型:2型糖尿病模型造模成功后,大鼠用代謝籠收集24 h尿液并進行測定,尿量>原尿量50% h、 尿蛋白排泄率>30 mg/24 h視為2型糖尿病腎病模型制備成功。

1.3 藥物干預造模成功后,空白對照組、模型組給予等量生理鹽水;糖腎灌腸方干預組給予0.13 mL/10 g糖腎灌腸方溶液;纈沙坦干預組給予纈沙坦片溶液0.12 mg/10 g;纈沙坦+糖腎灌腸方干預組給予0.13 mL/10 g糖腎灌腸方溶液和0.12 mg/10 g纈沙坦溶液;各組大鼠均每天1次,連續灌腸4周。見圖2。

空白對照組

1.4 取材(1)腹腔注射10%水合氯醛以麻醉大鼠,注射劑量330 μL/100 g;(2)剪開大鼠胸腔,由心臟采血后將血液置入離心管,靜置30 min后,3 000 r/min離心10 min,吸取上層血清凍存;(3)取腎臟,一半4%多聚甲醛固定 一半凍存;(4)取糞便凍存。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 血糖水平測量 采用血糖儀分別測量并記錄造模后給藥前大鼠的尾靜脈空腹血糖水平,空腹血糖水平>16.7 mmol/L視為2型糖尿病大鼠模型構建成功。

1.5.2 腎臟病理學檢查 大鼠麻醉處死后立刻剖腹游離出腎臟,用冰鹽水對腎臟進行灌洗,分離腎皮質,進行常規脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin staining,HE)染色、脫水、封片等操作處理,并在光鏡下對大鼠腎臟組織的形態學改變情況進行觀察。

1.5.3 24 h尿量、尿蛋白、BUN、Cr測定 2型糖尿病模型造模成功后,用代謝籠收集各組大鼠24 h尿液進行測定,尿量>原尿量50%、 尿蛋白排泄率>30 mg/24 h ,視為2型糖尿病腎病模型制備成功;采用自動生化分析儀分別測定各組大鼠BUN、Cr。

1.5.4 腎濕質量、腎臟肥大指數測定 大鼠麻醉處死后,立即剖腹游離出腎臟,用濾紙將上面的血跡吸干,采用電子天平稱量腎濕質量,并計算出腎臟肥大指數(Kidney hypertrophy index,KI)。計算公式如下:KI=右腎濕質量/體質量

1.5.5 TLR2、TLR4mRNA水平測定 采用實時定量聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)技術測定大鼠腎組織中的TLR4 mRNA水平。用總RNA抽提試劑(Total RNA extraction reagent,TRIZOL)從新鮮分離的大鼠腎組織中提純總RNA,采用互補DNA(Complementary DNA,cDNA)合成試劑盒獲得第一鏈cDNA,然后進行定量PCR反應,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,G3PDH)作為內參,采用2-△△Ct法得出結果并進行計算。基因引物序列如下:TLR4的正向引物序列為CATGGATCAGAAACTCAGCAAAGTC,反向引物序列為CATGCCATGCCTTGTCTTCA;TLR2的正向引物序列為TGGAGGTCTCCAGGTCAAATCT,反向引物序列為TGTTTGCTGTGAGTCCCGAG。

1.5.6 TLR2 和 TLR4蛋白表達水平測定 采用免疫印跡法(Western blotting,WB)測定大鼠腎組織中的TLR2、TLR4蛋白表達水平。取大鼠腎組織,加入組織裂解液后勻漿,離心后分離出上清液并,完成電泳后轉移至聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene fluoride,PVDF)膜,在4℃的環境下應用脫脂干奶(5%)封閉保存60 min, 然后經TLR2、 TLR4(1∶1 000稀釋)抗體及山羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)孵育,采用化學發光試劑盒在凝膠成像儀中成像,以G3PDH作為內參,使用ImageJ軟件進行條帶定量分析。

2 結果

2.1 各組大鼠空腹血糖水平及尿蛋白含量比較與空白對照組比較,各造模組血糖和尿蛋白含量均顯著升高(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸、纈沙坦干預組與纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的血糖降低但差異無統計學意義(P>0.05),糖腎灌腸方干預組、纈沙坦片干預組及纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的尿蛋白含量下降(P<0.05),且纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的尿蛋白含量顯著下降(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血糖、尿蛋白含量比較

2.2 各組大鼠腎組織病理學檢查結果比較與空白對照組比,模型組腎組織病變顯著,如腎小管擴張、纖維化、炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落;與模型組比較,糖腎灌腸干預方組和纈沙坦片干預組的大鼠腎小管擴張程度、炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落情況有所減輕。纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的大鼠腎小管基本無擴張,僅有少量炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落,腎臟結構接近空白對照組。見圖3。

(HE,×100) (HE,×200)

2.3 各組大鼠血清及糞便BUN、Cr含量比較與空白對照組比較,模型組血清Cr含量、糞便Cr含量、血清BUN含量及血/糞BUN比值顯著升高(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸方干預組、纈沙坦干預組及纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的血清Cr含量、糞便Cr含量、血清BUN含量及血/糞BUN比值下降(P<0.05)。見表2,圖4。

表2 各組大鼠血清及糞便BUN、Cr含量及比值比較

注：1,空白對照組;2,模型組;3,糖腎灌腸方干預組;4,纈沙坦干預組;5,纈沙坦+糖腎灌腸方干預組。

注：與空白對照組比較, *P<0.05; 與模型組比較, #P<0.05; 與糖腎灌腸方干預組比較, $P<0.05; 與纈沙坦干預組比較, &P<0.05。

2.4 各組大鼠腎濕質量及腎臟肥大指數比較與空白對照組比較,模型組的腎濕質量及腎肥大指數顯著增加(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸方干預組、纈沙坦干預組及纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的腎濕質量及腎肥大指數降低(P<0.05),且纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的腎濕質量及腎肥大指數明顯低于糖腎灌腸方干預組、纈沙坦干預組(P<0.05)。見表3。

表3 各組大鼠腎濕質量及腎肥大指數比較

2.5 各組大鼠TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達水平比較與空白對照組比較,模型組TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達均顯著上升(P<0.05);與模型組比較,糖腎灌腸方干預組、纈沙坦干預組以及纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達均下降(P<0.05)。見表4、圖4。

表4 各組大鼠TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白、TLR4蛋白表達水平比較

3 討論

2型糖尿病腎病是由糖尿病所引發的一類臨床常見腎臟疾病,以少尿、蛋白尿、血肌酐上升等為腎臟受損典型癥狀,其發生發展與遺傳、腎臟血流動力學變化、糖代謝異常、血壓升高等多種因素密切相關[3-6]。糖腎灌腸方為臨床上治療2型糖尿病腎病的一種中醫特色療法,以生大黃、丹參、澤瀉、黃芩等藥物為主要成分。相關研究表明,大黃不僅可以有效降低2型糖尿病腎病大鼠的血清尿素、肌酐水平,明顯改善腎臟的病變組織,還能夠對2型糖尿病腎病腎臟肥大及系膜細胞的增殖發揮抑制作用,從而對腎臟進行有效保護[7-8]。大量研究表明,采用中藥灌腸方式治療2型糖尿病腎病,既能有效降低患者的血清尿素、肌酐水平,又能抑制病情的進一步發展。另有研究發現,中藥液在腸腔存留的時間越久,則血清肌酐水平下降越顯著,對腎功能的改善作用也愈加明顯[9-12]。有研究表明纈沙坦可以通過擴張血管來緩解腎小球的高濾過狀態,從而使患者的蛋白尿情況得到有效改善。此外,纈沙坦還可以促進腎血流對局部炎癥的代謝,從而降低機體的炎性反應,并盡量減少炎癥反應對腎功能的損傷[13-15]。

2型糖尿病腎病患者的腎小球細胞受到損傷,會引起腎小球濾過功能下降,從而引發尿量減少及尿蛋白升高等病理性改變;BUN、Cr主要通過腎臟排泄[16-17]。當機體腎功能減退、腎小球濾過能力減弱時,血清中的BUN、Cr含量會明顯升高。因此,BUN、Cr可被視為腎臟實質損害的重要標志物,對于臨床評估腎功能意義重大。Toll樣受體為一類蛋白質分子,其能參與機體非特異性免疫應答并促進炎癥因子的合成及分泌[18]。研究表明,與健康人群比較,2型糖尿病腎病患者的血清TLR2、TLR4水平明顯升高,提示TLR2、TLR4在2型糖尿病腎病疾病進展中發揮重要作用[19]。有研究表明TLR2、TLR4為Toll樣蛋白受體家族中的重要成員,能夠促進炎性因子釋放,從而激活炎癥信號路徑,誘導腎小管間質纖維化,使腎小球發生硬化,進而引發腎功能障礙[20]。

本研究發現,與模型組比較,糖腎灌腸干預組、纈沙坦干預組與纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的血糖降低,尿蛋白含量下降,且纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的尿蛋白含量顯著下降,糖腎灌腸干預方組和纈沙坦片干預組的大鼠腎小管擴張程度、炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落情況有所減輕;纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的大鼠腎小管基本無擴張,僅有少量炎性細胞浸潤及壞死細胞脫落,腎臟結構更接近于空白對照組。提示糖腎灌腸方干預組、纈沙坦干預組以及聯合干預組在血糖、尿蛋白以及腎組織病理改變上的改善,表明這些干預措施對糖尿病腎病具有治療作用。其中,聯合干預的效果更佳,說明兩種藥物可能具有協同作用。

本研究發現,與空白對照組比較,各造模組的TLR2、TLR4蛋白及mRNA表達水平均明顯升高。結果提示,2型糖尿病腎病大鼠模型的炎癥反應較為明顯。與模型組比較,糖腎灌腸、纈沙坦干預組與纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的血清Cr含量、糞便Cr含量、血清BUN含量、血/糞BUN比值、腎濕重、腎肥大指數、TLR2mRNA、TLR4mRNA、TLR2蛋白及TLR4蛋白表達均降低,且纈沙坦+糖腎灌腸方干預組的降幅最大,證實了藥物干預對糖尿病腎病大鼠腎功能和炎癥反應的改善作用。且糖腎灌腸方和纈沙坦在抑制炎癥反應方面具有協同作用。原因為糖腎灌腸方中的生大黃、丹參等成分具有顯著的抗炎和抗氧化作用,可以抑制炎癥因子的合成及分泌。纈沙坦則能夠通過抑制腎素-血管緊張素系統來緩解腎小球的高濾過狀態,從而改善機體的炎癥反應。二者的聯合應用不僅在改善腎功能方面表現出更好的效果,還在抑制腎臟組織的TLR2、TLR4蛋白及mRNA的表達方面具有協同作用。這一發現對于2型糖尿病腎病的治療具有重要的意義。通過抑制TLR2、TLR4的表達,可以進一步抑制炎癥反應,從而減輕腎組織損傷,改善腎功能。此外,這種聯合用藥的方法還可以為2型糖尿病腎病的臨床治療提供新的思路和方法。

綜上,糖腎灌腸方聯合纈沙坦治療2型糖尿病腎病效果更佳,并能抑制大鼠腎臟組織TLR2、TLR4表達,值得在臨床上推廣應用。