寒喘祖帕單煎配方與配伍合煎對16HBE細胞抗炎活性及非靶向代謝組學差異的研究

曹萬萍, 李新霞,2, 李喬喬, 馬雪紅,4,閆 冬,4

(1新疆醫科大學藥學院; 2新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室, 烏魯木齊 830017;3西安高新醫院藥劑科, 西安 710075; 4新疆醫科大學實驗室與設備管理處, 烏魯木齊 830017)

寒喘祖帕顆粒是寒喘祖帕散的中藥復方制劑,出自經典醫著《如意處方》,主要由小茴香、芹菜子、神香草、玫瑰花、蕓香草、胡蘆巴、鐵線蕨、甘草浸膏、蕁麻子9味藥材組成,具有化痰平喘、潤肺止咳的功效,在臨床上用于急性感冒,寒性所致的咳嗽及哮喘的治療[1]。現代醫學研究表明,寒喘祖帕顆粒在聯合用藥發揮抗炎活性改善肺功能方面優于常規療法[2-4]。傳統中藥飲片配伍合煎是以充分發揮方藥多種成分的綜合療效達到中醫辨證施治效果,但該方法需浸泡煎煮,藥物煎煮器具或方式選擇不當可產生降低藥效甚至中毒等不良后果,在一定程度上限制了傳統中藥的應用[5-6]。中藥單煎配方顆粒是將單味中藥飲片加工提取后濃縮干燥制粒,臨床可直接配方應用的顆粒狀中藥,具有便于儲存、服用方便、免煎煮及配伍靈活的優點[7-10]。由于單煎配方缺少傳統組方中藥物“共煎”的過程,缺少復方藥物中有效成分的相互作用規律,會使一些成分的含量發生變化[11-12]。目前臨床使用的中藥單煎配方尚無統一的國家標準,質量評價體系尚不完善,導致同品種中藥單煎配方顆粒在臨床應用過程中的療效存在差異[13]。寒喘祖帕顆粒被證明在改善哮喘患者的肺功能和減少氣道炎癥方面發揮著重要作用[14-15]。本研究采用細胞炎癥模型考察寒喘祖帕傳統配伍合煎與單煎配方的抗炎活性差異,現報道如下。

1 材料

1.1 試藥甘草浸膏(批號20191204)、玫瑰花(批號 20191009-104)、葫蘆巴(批號 20191025-111)、芹菜子(批號 20191001-113)、神香草(批號 20190802-095)、鐵線蕨(批號 20190925-098)、蕁麻子(批號 20201229-001)、蕓香草(批號 20200617-026)、小茴香(批號20190814-106),藥材均購自新奇康藥業股份有限公司。亮氨酸-腦啡肽(美國 Waters 公司),甲酸鈉(美國 Sigma 公司),乙腈(LC-MS,美國 Fisher 公司),甲酸(上海麥克林生化科技有限公司),純化水(屈臣氏有限公司),地塞米松磷酸鈉(遂成藥業股份有限公司),LPS(奧默生物技術有限公司)。

1.2 儀器Xevo G2-XSQ-TOF型四極桿飛行時間質譜儀(美國Waters公司);ACQUITY UPLC BEHC18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)色譜柱(美國 Waters 公司);Heracell型CO2細胞培養箱(美國Thermo Scientific公司);Qu-antStudio型實時熒光定量PCR儀(美國Thermo Fisher公司);Multiskan型GO全自動酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.3 細胞人支氣管上皮細胞(16HBE細胞),購自武漢普諾賽生命科技有限公司。

2 方法

2.1 樣品的制備寒喘祖帕配伍合煎:分別稱取神香草(75 g)、鐵線蕨(75 g)、甘草浸膏(70 g)、小茴香(125 g)、 芹菜子(125 g)、 葫蘆巴(75 g)、 蕓香草(75 g)、玫瑰花(75 g)、蕁麻子(70 g),加入8倍量的水煎煮3次,每次1.5 h,合并煎液,濾過,濾液濃縮至相對密度為 1.32～1.35 g/cm3(60℃)的浸膏,真空干燥。寒喘祖帕單煎配方:除甘草浸膏外,分別稱取其他8味藥材各40 g,煎煮方法與配伍合煎一致,得到8種藥材提取物,常溫陰涼處儲藏;將9種藥材提取物按寒喘祖帕顆粒配方比例混勻,備用。

2.2 16HBE細胞炎癥模型的建立將16HBE細胞按1×105個/孔的密度接種到6孔板中,貼壁24 h后將培養基更換為無血清 DMEM饑餓24 h,采用0.1 μg/mL的LPS刺激48 h,以RT-PCR檢測炎癥因子的表達,建立細胞胞炎癥模型。

2.3 寒喘祖帕配伍合煎和單煎配方對LPS誘導的16HBE細胞存活率的影響將16HBE細胞按5×104個/孔的密度接種到96孔板中,分為空白組(培養基)、正常組(16HBE細胞+培養基)、模型組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS)、LPS誘導后加入不同濃度單煎配方(12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL)和配伍合煎(12.5、25、50、100、200、400、800 μg/mL)處理的細胞為各劑量單煎配方組和配伍合煎組。將接種細胞培養24 h后向模型組、單煎配方組配伍合煎組中加入0.1 μg/mL的LPS作用48 h,誘導炎癥損傷,構建細胞炎癥模型,隨后將各劑量單煎配方組和配伍合煎組更換含不同濃度單煎配方和配伍合煎的DMEM完全培養基繼續培養24 h,采用CCK-8法測定各孔450 nm處OD值,計算各組細胞存活率。每組設立6個復孔,重復3次實驗。細胞存活率/%=(A單煎配方組/配伍合煎組-A空白組)/(A正常組-A空白組)×100%。

2.4 不同濃度的單煎配方對LPS刺激的16HBE細胞炎癥因子的表達將16HBE細胞按1×105個/孔的密度接種到6孔板中,分為正常組(16HBE細胞+培養基)、模型組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS )、單煎配方低劑量組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS+50μg/mL單煎配方)、單煎配方高劑量組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS+100 μg/mL單煎配方)。將接種細胞培養24 h后向模型組、單煎配方組配伍合煎組中加入0.1 μg/mL的LPS作用48 h,構建細胞炎癥模型,后將各劑量單煎配方組更換含不同濃度單煎配方的DMEM完全培養基繼續培養24 h,進行RT-PCR檢測。以Actin為內參,以2-△△Ct法計算基因的相對表達量,重復3次實驗。相關引物序列見表1。

表1 引物序列信息

2.5 寒喘祖帕配伍合煎和單煎配方對LPS刺激的16HBE細胞炎癥因子的表達將16HBE細胞按1×105個/孔的密度接種到6孔板中,分為正常組(16HBE細胞+培養基)、模型組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS)、寒喘祖帕單煎配方組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS +50 μg/mL單煎配方)、寒喘祖帕配伍合煎組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS+50 μg/mL配伍合煎)。將接種細胞培養24 h后向模型組、單煎配方組配伍合煎組中加入0.1 μg/mL的LPS作用48 h,構建細胞炎癥模型,后將單煎配方組和配伍合煎組更換含50 μg/mL濃度單煎配方和50 μg/mL濃度配伍合煎的DMEM完全培養基繼續培養24 h,進行RT-PCR檢測。以Actin為內參,2-(△△Ct)法計算IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的相對表達量。每組3個復孔,重復3次實驗。計算公式:△CT(正常組)=(CT(目的基因)- CT(內參基因))/n;2-(△△Ct)= 2[CT(目的基因)-CT(內參基因)-△CT(正常組)]。

2.6 代謝物指標的測定將16HBE細胞分為4組:正常組(16HBE細胞+培養基)、模型組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS)、寒喘祖帕單煎配方組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS+50 μg/mL單煎配方)、寒喘祖帕配伍合煎組(16HBE細胞+培養基+0.1 μg/mL LPS+50 μg/mL配伍合煎),將接種細胞培養24 h后向模型組、單煎配方組配伍合煎組中加入0.1 μg/mL的LPS作用48 h,構建細胞炎癥模型,后將單煎配方組和配伍合煎組更換含50 μg/mL濃度單煎配方和50 μg/mL濃度配伍合煎的DMEM完全培養基繼續培養24 h,后用預冷的80%乙腈裂解4組細胞后置在-80℃反復凍融3次,4℃下14 650 r/min離心10 min,取上清液氮氣吹干,沉淀用100 μL的50%乙腈復溶,渦旋2 min,4℃下17 900 r/min離心10 min,取上清液置EP管中,4℃下17 900 r/min再次離心10 min;采用UPLC-Q-TOF/MS,檢測條件為:(1)色譜條件:柱溫:35℃;自動進樣器溫度:10℃;流動相:0.1%甲酸水(A)-乙腈(B);梯度洗脫程序:0～0.5 min,2%～7%B,0.5～15 min,7%～40%B,15～22 min,40%～67%B,22～25 min,67%～100%B,25～40 min,100%～2%B;流速:0.3 mL/min;進樣量:5 μL;運行時間:40 min。(2)質譜條件:離子源為電噴霧離子化源(ESI),靈敏度模式下,分別采用正、負離子檢測模式(ESI+、ESI-);掃描范圍:50～1 200 Da;掃描時間:1 s;錐孔電壓:30 V;碰撞能量(CE):6 V。測定4組樣品,同步制備質量控制(Quality control,QC)樣品進樣分析。

3 結果

3.1 配伍合煎及單煎配方對LPS誘導的16HBE細胞存活率的影響與正常組比較,模型組細胞存活率為(97.40±2.99)%,差異無統計學意義(P>0.05);單煎配方組在給藥濃度<50 μg/mL時,細胞存活率未受到影響,差異無統計學意義(P>0.05);在給藥濃度≥100 μg/mL時,細胞存活率下降,差異有統計學意義(P<0.01);配伍合煎組在給藥濃度0～400 μg/mL范圍時,細胞存活率未受到影響,差異無統計學意義(P>0.05),在給藥濃度≥800 μg/mL時,細胞存活率下降,差異有統計學意義(P<0.05),見表2、3。

表2 不同濃度的單煎配方對LPS誘導的16HBE細胞存活率的影響

表3 不同濃度的配方合煎對LPS誘導的16HBE細胞存活率的影響

3.2 不同濃度單煎配方對LPS刺激的16HBE細胞炎癥因子表達的影響與正常組比較,模型組 IL-6、IL-8、TNF-α mRNA的表達升高,差異有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,單煎配方高、低劑量組IL-6、IL-8及TNF-α mRNA的表達均降低,差異有統計學意義(P<0.05),其中在濃度50 μg/mL時的抗炎效果強于100 μg/mL,故采用50 μg/mL濃度進行后續試驗,見表4。

表4 單煎配方不同劑量對LPS誘導的16HBE細胞炎癥因子的影響

3.3 寒喘祖帕配伍合煎及單煎配方對LPS刺激的16HBE細胞炎癥因子表達的影響與正常組比較,模型組 IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達升高,差異有統計學意義(P<0.001);與模型組比較,配伍合煎組、單煎配方組、地塞米松組IL-6、IL-8、TNF-α mRNA表達均降低, 差異有統計學意義(P<0.001);與單煎配方組比較,配伍合煎組IL-6、IL-8 mRNA表達降低,差異有統計學意義(P<0.05),見圖1。

注: 與正常組比較, ###P<0.001; 與模型組比較, ***P<0.001; 與配伍合煎組比較, *P<0.05。

3.4 代謝組學分析

3.4.1 不同組間細胞代謝組學輪廓分析 比較正常組、模型組、配伍合煎組及單煎配方組細胞樣本分別在質譜正、負離子模式下總離子圖,各組峰型及峰面積存在一定差異,表明各組樣品代謝物濃度存在一定差異,見圖2。

注:A為正離子模式;B為負離子模式。

3.4.2 代謝產物的PCA分析和OPLS-DA分析 本實驗的QC樣本在 PCA 得分圖上具有較好的集中度,表明所建方法的重復性和穩定性良好,所得差異物能反映樣本之間的生物學差異。正常組與模型組各組樣本點相對集中,兩組之間分離良好,說明造模后,內源性代謝產物存在顯著差異。對空白組和模型組進行PCA分析,顯示兩組在組內聚集良好,并且兩組之間有明顯的分離趨勢,見圖3。

注:正常組(a)、模型組(b)、配伍合煎組(c)、單煎配方組(d)、QC組(e)。

進一步對模型組和配伍合煎組、模型組和單煎配方組進行OPLS-DA分析,正、負離子模式下,樣本間橫向距離越遠表明組間差異越大,縱向距離越近表明組內重復性越好,配伍合煎組和單煎配方組與模型組分布于不同象限區域內,組內樣品點聚集良好,樣本全部處于95%置信區間內,所得代謝組的模型參數為正常組與模型組之間ESI+:R2X=0.885;R2Y=1;Q2=0.998;ESI-:R2X=0.935;R2Y=1;Q2=0.992;模型組與配伍合煎組之間ESI+:R2X=0.919;R2Y=0.999;Q2=0.995;ESI-:R2X=0.952;R2Y=0.999;Q2=0.998;模型組與單煎配方組之間ESI+:R2X=0.929;R2Y=1;Q2=0.999;ESI-:R2X=0.931;R2Y=1;Q2=0.777,表明建立炎癥模型給藥后,代謝物發生顯著性變化,見圖4。

注： a為正常組, b為模型組, c為LPS+配伍合煎組, d為LPS+單煎配方組。 A為正常組和模型組的正離子圖, B為正常組和模型組的負離子圖, C為模型組和LPS+配伍合煎組的正離子圖, D為模型組和LPS+配伍合煎組的負離子圖, E為模型組和LPS+單煎配方組的正離子圖, F為模型組和 LPS+單煎配方組的負離子圖。

3.4.3 內源性差異代謝物的篩選 在OPLS-DA模型的基礎上,以變量投影重要性(VIP)>1、P<0.05且差異倍數(fold change)≥1.5篩選內源性差異代謝物,根據潛在生物標志物色譜峰的保留時間、一級、二級質譜等信息并結合HMDB在線數據庫進行鑒定,模型組與配伍合煎組間識別出內源性差異代謝物68個,見表5;模型組與單煎配方組識別出內源性差異代謝物62個,見表6。

表5 模型組與配伍合煎組內源性差異代謝物(前20名)

表6 模型組與單煎配方組內源性差異代謝物(前20名)

3.4.4 模型組與配伍合煎組、模型組與單煎配方組代謝物的代謝通路富集分析結果 分別將模型組與配伍合煎組、模型組與單煎配方組篩選得到的差異代謝物進行代謝通路富集分析,配伍合煎組主要富集到的代謝通路分別為色氨酸代謝、甘油磷脂代謝、嘧啶代謝等;單煎配方組主要富集到的代謝通路有甘油磷脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝、乙醚脂類等,見圖5。與空白組對比,模型組中色氨酸含量降低;與模型組比較,配伍合煎和單煎制劑中色氨酸含量升高,見圖6。

注: A為模型組和LPS+配伍合煎組; B為模型組和LPS+單煎配方組。

注: a為正常組; b為模型組; c為LPS+配伍合煎組; d為LPS+單煎配方組。

4 討論

本研究通過分析配伍合煎和單煎配方寒喘祖帕對LPS誘導的炎癥細胞模型的抗炎活性作用,結果表明在同樣的給藥濃度及給藥時間條件下,配伍合煎組的細胞毒性遠小于單煎配方,實驗結果與傳統中醫藥中配伍協同、增效減毒的理論一致;配伍合煎組和單煎配方組均具有降低LPS誘導的細胞炎癥因子即IL-6、IL-8和TNF-α的mRNA的表達水平,但配伍合煎組降低IL-6和IL-8兩個炎癥因子的活性作用相比于單煎配方更加顯著。

非靶向代謝組學結果顯示正常組與模型組內源性差異代謝物存在顯著性差異,且各組樣本聚集良好,給藥加寒喘祖帕干預后,配伍合煎組輪廓趨向于正常狀態;代謝通路富集分析顯示,配伍合煎組中主要富集到色氨酸代謝、甘油磷脂代謝、嘧啶代謝三條代謝通路,單煎配方組中主要富集到甘油磷脂代謝、精氨酸和脯氨酸代謝通路。甘油磷脂代謝和色氨酸代謝顯著影響炎癥細胞代謝水平,甘油磷脂是組成細胞膜的主要成分,可釋放TNF-α和IL-6等炎癥因子[16];文獻研究表明色氨酸代謝產生的多種生物活性化合物可以調節各種生理功能[17-19],可加重或預防與炎癥相關的疾病[20-22]。差異代謝物色氨酸的含量在配伍合煎組中變化顯著,提示配伍合煎組可能通過上調色氨酸等相關代謝物來發揮抗炎作用。

綜上,本研究采用LPS誘導16HBE細胞建立炎癥細胞模型,對寒喘祖帕單煎配方與配伍合煎兩種方式的抗炎活性進行了分析,結果表明兩種方式的抗炎活性存在差異;代謝組學分析寒喘祖帕單煎配方與配伍合煎抗炎活性的差異可能是由于作用于不同的代謝通路。后續本研究將進一步對入細胞成分進行分析,明確寒喘祖帕抗炎活性的藥效物質基礎,為寒喘祖帕顆粒的進一步研究提供數據支持。