蕪菁多糖鐵配合物的合成工藝研究

阿曼妮薩·麥提如則, 吳美美, 王 鑫, 劉 瑾, 徐 茜, 海力茜·陶爾大洪

(新疆醫科大學1藥學院, 2基礎醫學院, 烏魯木齊 830017)

新疆蕪菁(BrassicarapaL.)為十字花科屬種植物蕪菁的根莖,其主要化學成分為黃酮、多糖、生物堿、皂苷、揮發油等[1-2],具有抗衰老、抗輻射、預防心血管疾病的作用[3-4]。其中的多糖具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞等作用[5-7]。多糖鐵配合物(Polysaccharide-iron complex,PIC)是生物多糖與鐵離子通過三氯化鐵共熱法復合而成的一種多糖和鐵元素的配合物,用作補鐵劑時,不僅結構穩定、溶解性好、對胃腸道刺激性小,還具有鐵螯合能力強、生物利用度廣等優點,補鐵的同時,還能起到促進血液循環、降血糖、調節血壓等作用[8-9]。本研究采用蕪菁多糖與FeCl3共熱法建立BP-Fe(Ⅲ)配合物的最佳合成方法,測定鐵的含量,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥蕪菁干燥片(新疆艾力努爾有限公司);鐵標準溶液(北京嘉世玉禾化工技術研究院,083183);三氯化鐵(天津鑫伯特化工有限公司,20221108);枸櫞酸鈉(天津永晟精細化有限公司,20140416);1.10-菲啰啉(天津天新精細化工開發中心,20191102);氯化羥胺(天津天新精細化工開發中心,20140102);乙酸鈉(天津鑫伯特化工有限公司,202200706);無水乙醇(天津鑫鉑特化工有限公司,20211208);硫氰酸鉀(成都科隆化學品有限公司,2017050101);氫氧化鈉(天津盛奧化學試劑有限公司,20160307);95%乙醇(天津凱通化學試劑有限公司,20221125);冰乙酸(天津富宇精細化工有限公司,20120911)。

1.2 儀器800T型多功能粉碎機(永康敏業工貿有限公司);AB135-8型分析天平(常州幸運電子設備有限公司);N-1001型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司);電熱恒溫水浴鍋(北京永光明醫療儀器有限公司);SHB-lll型循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司);BY111-0-100酒精計(河北省武強縣滏陽儀表廠);UV-2700型紫外分光光度計(島津儀器有限責任公司)。

1.3 蕪菁多糖的提取與除蛋白方法

1.3.1 蕪菁粗多糖的提取方法 取脫脂后的蕪菁100 g,加水3 L,在90℃溫度條件下回流提取提取3次,每次120 min,將提取液濃縮,加入無水乙醇至濃度為 80%(v/v),在4℃條件下放置12 h。抽濾溶液,將沉淀室溫下晾干后,用蒸餾水復溶,將溶液倒入7 000 Da分子量的透析袋,透析完畢后將袋內溶液凍干,即得蕪菁粗多糖。

1.3.2 蕪菁粗多糖的除蛋白方法 采用AB-8大孔吸附樹脂濕法裝柱(柱床體積700 mL),吸取“1.3.1”項下蕪菁粗多糖上清液緩慢上樣,靜態吸附15 min,控制流速,收集流出液。用7 000 Da的透析袋透析,濃縮,冷凍干燥,即得到蕪菁多糖。

1.4 BP-Fe(Ⅲ)配合物的合成方法取“1.3.2”項下蕪菁多糖0.2 g和枸櫞酸鈉0.1 g于燒杯中,加入50 mL蒸餾水溶解,加入2 mol/L FeCl3溶液和20%的NaOH溶液,使溶液pH值為8,觀察反應液,當反應液中生成的沉淀不再溶解時停止加FeCl3溶液和NaOH溶液,繼續反應2 h。待反應完全后將反應液轉移到離心管中,8 000 r/min離心25 min,棄去沉淀,將上清液用3倍體積的無水乙醇醇沉,在4℃條件下放置12 h。將醇沉混懸液至于離心管中,8 000 r/min離心5 min,棄去上清液,將沉淀物用無水乙醇洗滌,8 000 r/min離心3次,每次5 min。取出沉淀自然干燥,即得到BP-Fe(Ⅲ)配合物。用適量蒸餾水溶解BP-Fe(Ⅲ)配合物,充分溶解后,將所得溶液置于透析袋中除鹽,濃縮后冷凍干燥,即得BP-Fe(Ⅲ)配合物。

1.5 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成單因素實驗設計考察不同時間、溫度、反應液pH值、枸櫞酸鈉和蕪菁多糖質量比(m1/m2)對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響,單因素實驗設計見表1。

表1 單因素實驗設計表

1.6 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成工藝的正交實驗設計根據“1.5”項下所得結果,對BP-Fe(Ⅲ)配合物的合成工藝進行優化,正交實驗設計見表2。

表2 L9(34)正交實驗因素水平表

1.7 BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的測定吸取0、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、10.00 mL標準鐵溶液(10 μg/mL)至50 mL容量瓶中,分別加入1.0 mL 10%氯化羥胺溶液,混合均勻,放置5min后,加入0.15%1.10-菲啰啉2.0 mL,1.0 mol/L的乙酸鈉溶液5.0 mL ,加蒸餾水定容至刻度,混勻,靜置顯色20 min,測定510 nm處A值[10],以鐵的質量濃度為橫坐標,吸光度為縱坐標繪制標準曲線,回歸方程為:Y=0.195 3X+0.000 7,R2=0.999 9。配制300 μg/mL的樣品溶液,從中移取5 mL,轉移至25 mL容量瓶中,按標準曲線方法進行相同操作,將測得結果代入標準曲線中,計算BP-Fe(Ⅲ)配合物中的鐵含量。鐵含量/%=MFeM多糖鐵×100%。

1.8 方法學考察

1.8.1 精密度實驗 量取“1.7”項下標準鐵溶液5 mL按照“1.7”項下方法,連續測定510 nm處A值5次,計算RSD值。

1.8.2 穩定性實驗 量取“1.7”項下供試品溶液5 mL按照“1.7”項下方法, 分別在0、 30、 60、 90、 120 min時在510 nm處A值,計算RSD值。

1.8.3 重現性實驗 將同一樣品溶液平行配置6份按“1.7”項下方法,測定510 nm處吸光度A值,計算RSD值。

1.8.4 加樣回收率實驗 取“1.7”項下樣品溶液(0.3 mg/mL)分別吸取9份溶液,每份0.2 mL,每3份1組,分別加鐵標準溶液(0.01 mg/mL) 0.86、1.10、1.30 mL于3組溶液中,搖勻,加水至2.0 mL,按照“1.7”項下方法測定510 nm處的A值,計算RSD值。

1.9 鐵離子特征反應分別配置10 mg/mL的BP-Fe(Ⅲ)配合物溶液和三氯化鐵溶液,分別取5 mL加1 mL 10%硫氰酸鉀,振蕩,觀察現象。

1.10 BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜測定采用溴化鉀壓片法,將干燥的BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖樣品分別與溴化鉀混合,磨粉壓片,在4 500～500 cm-1處掃描,掃描10次,測得BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜圖。

2 結果

2.1 反應pH值、時間、溫度和櫞酸鈉與多糖的質量比對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當反應時間為2 h,反應溫度為60℃,枸櫞酸鈉與多糖的質量比為1∶2時,隨著pH增大,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量降低,當pH為6時BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量最高為3.41%,見圖1。

圖1 pH值對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.2 反應時間對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當反應溫度為60℃,枸櫞酸鈉與多糖的質量比為1∶2,pH值為8時,隨著反應時間增長,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量降低,在1 h時BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量最大為1.6%,見圖2。

圖2 反應時間對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.3 反應溫度對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當反應時間為2 h,pH值為8,枸櫞酸鈉與多糖的質量比為1∶2時,隨著反應溫度升高,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量先升高后降低,當溫度小于60℃時,隨溫度的升高BP-Fe(Ⅲ)配合物鐵含量逐漸升高,在60℃時鐵含量最高為3.89%。反應溫度大于60℃時,鐵含量降低,見圖3。

圖3 反應溫度對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.4 枸櫞酸鈉與多糖的質量比對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響當反應時間為2 h,pH值為8,反應溫度為60℃時,隨著枸櫞酸鈉與多糖質量比增加,BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量升高,當枸櫞酸鈉與多糖質量比為2∶1時BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量最大為1.81%,見圖4。

圖4 枸櫞酸鈉與多糖的質量比對BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量的影響

2.5 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成正交實驗結果正交實驗結果顯示,影響BP-Fe(Ⅲ)配合物中鐵含量因素的順序為枸櫞酸鈉和蕪菁多糖質量比(A)大于反應液pH值(B)大于反應時間(C)大于反應溫度(D)。最優合成工藝條件為A3B1C3D2,即枸櫞酸鈉和多糖質量比2∶1,反應時間3 h,反應液pH=6,反應溫度60℃為最佳工藝條件,見表3。

表3 BP-Fe(Ⅲ)配合物合成正交實驗結果

2.6 方法學考察結果

2.6.1 精密度實驗 精密度實驗結果表明RSD為1.6%(n=6)<2.0%,表明儀器精密度良好,見表4。

表4 精密度實驗

2.6.2 穩定性實驗 穩定性試驗結果表明RSD為1.8%(n=5)<2.0%,表明方法穩定性良好,見表5。

表5 穩定性實驗

2.6.3 重現性實驗 重現性試驗結果表明RSD為0.9%(n=6)<2.0%,表明方法重現性良好,見表6。

表6 重復性實驗

2.6.4 加樣回收率實驗 平均回收率為88.3%～104.7%,RSD在0.4%～1.4%之間,表明方法準確可行,見表7。

表7 加樣回收率實驗

2.7 鐵離子特征反應結果三氯化鐵溶液與硫氰酸鉀反應,顏色由黃色變為暗紅色;蕪菁多糖鐵溶液加入硫氰酸鉀之后沒有顏色變化,說明配合物中游離的Fe3+濃度很低,不能與硫氰酸鉀反應生成有顏色的配合物,蕪菁多糖與鐵絡合成穩定的配合物。鐵離子特征反應結果見圖5。

(A:顯色反應前;B:顯色反應后)

2.8 BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜圖分析BP-Fe(Ⅲ)配合物主要基團特征吸收峰與蕪菁多糖相似,BP-Fe(Ⅲ)配合物在3 400～3 300 cm-1附近的羥基特征吸收峰較蕪菁多糖寬,最大吸收峰由3 379 cm-1變為3 387 cm-1。說明蕪菁多糖與Fe3+形成穩定配合物后,基本結構無較大變化;在BP-Fe(Ⅲ)配合物合成過程中,反應物蕪菁多糖結構中的的羰基和羥基參與配合反應,鐵離子具有吸電子作用,可增大羰基極化程度,使羰基振動偶極矩變大,可見1 620 cm-1處羰基伸縮振動強度增加,推斷BP-Fe(Ⅲ)中存在與FeOOH相似的結構,見圖6。

圖6 BP-Fe(Ⅲ)配合物和蕪菁多糖的紅外光譜圖

3 討論

缺鐵性貧血(Iron deficiency anemia,IDA)為營養缺乏性疾病,病因多為患者長期處于鐵攝入不足或患者自身鐵成分丟失過快,不足以為紅細胞提供所需鐵成分的狀態,進而引起的貧血癥狀[11]。目前臨床上主要應用硫酸亞鐵、右旋糖酐鐵等口服補鐵劑進行治療,但其穩定性較差、不易吸收,并且容易引起惡心、便秘、胃腸道不適等不良反應[12]。PIC作為新型補鐵劑,具有安全性高、不良反應少、鐵元素更易于被人體吸收等優勢,成為國內外新型補鐵劑研究的熱點[13-14]。有研究發現制備多糖鐵的方法以FeCl3法、硫酸鐵銨法及模擬生物礦化法為主,其中FeCl3法工藝相對成熟,制作的周期短、產物的鐵含量高,成本低已成為現今制備多糖鐵的主要方法[15]。蕪菁作為一種藥食同源植物,栽培歷史悠久,產量較高、品質優良,耐儲藏,供應時間長,多糖含量高,以蕪菁為原料制備多糖鐵配合物具有原料來源廣的特點[16]。

本實驗用FeCl3法,與蕪菁多糖合成BP-Fe(Ⅲ)配合物,通過正交實驗優化得到最優合成工藝,為開發新型口服補鐵劑提供參考。