TNIP1基因單核苷酸多態性及其mRNA表達水平與老年慢性心力衰竭患者肺部感染的相關性分析

許 瀟, 徐華娟, 李 洺, 嚴姝瑛, 高鳳英, 陳慧琳

(上海建工醫院1重癥醫學科, 2呼吸科, 上海 200083)

肺部感染是老年慢性心力衰竭患者最常見的并發癥,且會進一步加重患者心臟負擔,對患者預后造成不良影響[1]。然而,肺部感染的早期臨床癥狀不明顯,診斷困難,為早期治療造成了困難。因此,尋找老年慢性衰竭患者發生肺部感染的高危因素,對盡早識別高危人群并采取預防手段,從而改善患者預后具有重要意義。患者免疫功能低下是受到細菌侵襲及感染的重要危險因素[2]。腫瘤壞死因子誘導蛋白3相互作用蛋白1(TNFAIP3-interacting protein 1,TNIP1)基因表達的蛋白產物是一種多泛素結合蛋白,是一種維持機體免疫穩態的重要物質[3]。TNIP1表達升高可引起B細胞反應減弱、血清免疫球蛋白含量降低和自身抗體水平下降[4]。研究表明,個體的TNIP1水平有差異,這種差異可能是由于基因單核苷酸變異導致的[5]。基于此,本研究旨在探討老年慢性心力衰竭肺部感染患者的TNIP1基因單核苷酸多態性及其表達水平,以期為預防老年慢性心力衰竭肺部感染及早期干預提供新的思路和方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象選擇2019年10月至2022年10月于上海建工醫院重癥醫學科就診的130例老年慢性心力衰竭患者作為研究對象。依據《醫院感染診斷標準(2001)》對肺部感染進行診斷,參照《全國臨床檢驗操作規程》對病原菌進行鑒定,根據是否于院內發生肺部感染分為肺部感染組和未感染組。納入標準:(1)年齡≥65周歲;(2)符合《2016年歐洲心臟病學會急慢性心力衰竭診斷與治療指南》中慢性心力衰竭診斷標準;(3)臨床和實驗室資料完整;(4)住院前及住院48 h內未發生急、慢性感染。排除標準:(1)合并嚴重肝、腎功能不全或惡性腫瘤;(2)患有血液系統疾病、內分泌疾病或自身免疫性疾病;(3)入院前3個月使用激素類藥物;(4)入院前即出現感染灶。本研究通過醫院倫理委員會審查批準(審批號:JGYYLL-2019001),所有患者或家屬均自愿參與研究,并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 一般資料的收集 包括研究對象的性別、年齡、BMI、病因、心功能分級和有無吸煙、飲酒史等情況。

1.2.2 TNIP1基因多態性的檢測 患者住院當天采集2 mL外周靜脈血,置EDTA抗凝管中,-80℃冷凍保存。應用Nanodrop2000對所提取的基因組DNA濃度進行測定,并在-20℃條件下冷凍放置。確定TNIP1基因的兩個SNP位點rs6889239(T>C)、 rs17728338(A>G), 然后應用毛細管電泳和片段分析(SNaPshot)技術對其進行基因分型。由上海天昊公司設計及提供引物,引物序列如下。rs6889239:F,5′-CCCTCGCTTATCTGGTCTGT-3′;R,5′-AAGGATTGCCCAAGGTCAGA-3′;擴增產物長度為98 bp。rs17728338:F,5′-GTAAAATTTGTGGTTCAGC-3′;R,5′-TGGAAGGGTGCAAGCAGTT-3′;擴增產物長度為102 bp。采用三步法進行PCR擴增反應:首先,在95℃條件下預變性5 min;然后,于95℃條件下變性10 s,再在55℃條件下退火30 s,于72℃條件下延伸45 s,總共擴增35個循環。PCR擴增產物的完整性使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 TNIP1基因mRNA表達水平的檢測 入院當天采集患者的外周靜脈血2 mL,采用Ficoll密度分離法分離患者外周血單核細胞,依據Trizol試劑盒說明書提取總RNA,逆轉錄合成cDNA,進行定量實時熒光定量聚合酶鏈式反應。TNIP1基因的引物序列:F,5′-CCAAGACCCTGAACTACGCA-3′;R,5′-CCCAACTACTTCCCCCATCT-3′。內參基因β-actin的引物序列:F,5′-TCCGCGCTACTGTCTTCTCT-3′;R,5′-TCGTGACGAGTAATCCTA-3′。首先,于94℃條件下預變性10 min;其次,95℃條件下變性15 s,于60℃條件下退火30 s;最后,75℃條件下延伸1 min,共進行40次循環。反應結束后應用標準曲線法對所得數據進行相對定量分析,采用2-ΔΔCt法對結果進行計算。

2 結果

2.1 感染組和未感染組一般資料比較130例患者中32例患者發生肺部感染,98例患者未發生肺部感染。感染組與未感染組患者的一般資料比較差異均無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 感染組和未感染組一般資料的比較

2.2 感染組和未感染組TNIP1基因型分布及等位基因頻率比較TNIP1基因rs6889239位點在感染組和非感染組之間的基因型分布以及等位基因頻率的差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 感染組和未感染組TNIP1基因型分布及基因頻率的比較

2.3 感染組和未感染組外周血TNIP1基因表達水平的比較感染組外周血TNIP1基因mRNA表達水平為2.34±0.34,顯著高于未感染組患者1.79±0.23,差異有統計學意義(t=4.225,P<0.001)。

2.4 外周血TNIP1基因表達水平預測肺部感染的價值分析ROC曲線分析結果顯示,外周血TNIP1基因表達水平預測慢性心力衰竭患者發生肺部感染的曲線下面積為0.887[(95%CI=0.803～0.972),P<0.001],截斷值為2.11,靈敏度和特異度分別為71.9%和95.9%,見圖1。

圖1 外周血TNIP1基因表達水平預測肺部感染的ROC曲線

2.5 TNIP1基因多態性對基因表達水平的影響感染組和非感染組TNIP1基因rs6889239位點不同基因型患者的外周血TNIP1基因的表達水平比較差異均無統計學意義(P>0.05),而rs17728338位點不同基因型患者的外周血TNIP1基因表達水平比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 TNIP1基因多態性對基因表達水平的影響

3 討論

慢性心力衰竭患者由于心臟結構異常和功能不全容易導致呼吸功能障礙;老年慢性心力衰竭患者由于機體免疫力降低,體內菌群穩態減弱,更容易發生肺部感染[6-9]。TNIP1是維持機體免疫功能的重要物質,且其表達水平可能與基因變異有關[10]。本研究發現TNIP1基因rs17728338變異與老年慢性心力衰竭患者肺部感染的發生有關,隨著rs17728338位點突變型等位基因頻率的升高,患者發生肺部感染的風險增大。此外,感染組外周血TNIP1基因mRNA表達水平顯著高于未感染組患者,并且發生TNIP1基因rs17728338位點變異的老年慢性心力衰竭患者基因表達水平升高,發生肺部感染的風險增大。

TNIP1基因位于5號染色體上,rs6889239和rs17728338位點位于該基因第一個內含子區,已被證實與疾病的發生、發展機制有關[11-13]。研究表明,TNIP1基因rs6889239位點中的C等位基因與系統性紅斑狼瘡患者腎臟受累發生率和類風濕性關節炎患者較低的發病年齡有關[4];TNIP1 基因rs17728338 G等位基因與癥狀性人類呼吸道合胞病毒(Human respiratory syncytial virus,HRSV)感染和嬰兒毛細支氣管炎的發生概率降低有關[10];TNIP1基因rs17728338多態性與牛皮癬易感性顯著相關[14]。提示TNIP1多態性可能影響對HRSV疾病的易感性。

本研究ROC曲線分析結果顯示,外周血TNIP1基因表達水平對預測慢性心力衰竭患者發生肺部感染特異度較好,但靈敏度較低。提示,外周血TNIP1基因表達水平預測慢性心力衰竭患者是否發生肺部感染可能存在一定的漏診風險。此外,隨著突變等位基因G頻率的增加,患者外周血TNIP1基因表達水平隨之升高,這一結果提示TNIP1基因rs17728338位點變異可能會影響基因表達水平。邱新峰等[15]研究也證實基因單核苷酸多態性與基因表達水平密切相關。

綜上所述,TNIP1基因rs17728338位點變異及基因表達水平與老年慢性心力衰竭患者發生肺部感染有關。