利拉魯肽激活Wnt/β-catenin信號通路保護大鼠急性脊髓損傷后神經功能的分子機制研究

崔擁國, 楊成亮, 李曉強, 李奕廷, 黃 昊, 劉 佳

(1廣西壯族自治區右江民族醫學院/2右江民族醫學院附屬醫院, 廣西 百色 533000)

脊髓損傷對患者的生命健康和生活質量造成了嚴重危害,加重了患者家庭及社會的負擔[1]。既往數據表明,每10億人中每年有約2萬例新發脊髓損傷患者,并有逐漸老齡化的趨勢[2]。脊髓受損可分為原發性和繼發性兩種情況。前者是指直接或間接作用于脊髓的外部力量所造成的損傷,而后者則是指外部力量導致脊髓水腫、椎管內微血管破裂形成血腫、骨折造成脊髓受壓以及椎間盤組織破裂等進一步損害脊髓的情形。脊髓損傷患者可能面臨損傷介導的各種多系統并發癥,包括細胞凋亡和炎癥[3]。Wnt/β-catenin信號通路參與細胞增殖、神經形成及凋亡等多種生物學過程[2]。β-catenin蛋白是一種進化保守的多功能蛋白,是Wnt/β-catenin信號通路的關鍵核心成員,可通過與核轉錄因子結合發揮對下游靶基因表達的調控作用[4]。有文獻[5]報道Wnt/β-catenin通路的激活在脊髓損傷中具有抗凋亡和抗炎作用。利拉魯肽是目前國際上廣泛應用于2型糖尿病的降糖藥。近年來的研究表明,利拉魯肽可以引發自噬,防止氧化,減少神經炎癥的發生[6]。有研究表明利拉魯肽可通過激活Wnt/β-catenin信號通路在多種疾病的治療中發揮作用[7-8]。然而,利拉魯肽治療脊髓損傷的分子機制尚未明確。因此,本研究探討利拉魯肽通過Wnt/β-catenin通路對急性脊髓損傷大鼠運動功能、神經細胞凋亡及炎癥因子水平的影響,為利拉魯肽治療脊髓損傷的臨床應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 由廣東維通利華實驗動物技術有限公司提供60只SPF清潔級健康雄性SD大鼠[許可證號:SCXK(粵)2022-0063)],鼠齡7～8周,體重280～320 g。本研究所有流程通過了右江民族醫學院動物倫理學委員會的審核(審查號:YYFY-LL-2024-217),實驗過程嚴格按照動物倫理學有關規定進行。

1.1.2 主要儀器、藥物及試劑 多功能酶標儀(美國珀金埃爾默股份有限公司);高速冷凍離心機(HC-2518R)(安徽中科中佳科學儀器有限公司);聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction,PCR)儀(美國伯樂生命醫學產品有限公司);XAV939(純度99.49%,AbMole中國分公司);酶聯免疫吸附試驗(Enzyme linked immunosor-bent assay,ELISA)試劑盒(美國Tsz Biosciences公司);二氫乙錠(hyfrothidine,HEt)(美國Medchemex-press公司);β-連環蛋白(β-catenin)、白介素6(IL-6)、胱天蛋白酶3(caspase-3)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)和β-肌動蛋白抗體(β-actin抗體)均由abcam公司提供;山羊抗兔WB二抗(武漢博士德公司)。

1.2 急性脊髓損傷大鼠模型建立及分組60只SD大鼠隨機選取15只作為假手術組(僅接受T9～T10椎板切除術),其余45只大鼠采用改進Allens技術建立急性脊髓損傷模型。腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)進行麻醉,消毒和切開大鼠背部,暴露棘突,去除T9～T10椎板后清晰暴露脊髓。然后,從3 cm的高度落下一個打擊器(重量10 g,直徑2 mm)打擊T10節段脊髓。造模成功判定標準為:擊打處脊髓出現淤血,大鼠全身抖動,雙下肢迅速退縮和顫抖,并有大小便失禁等。脊髓損傷模型建立成功后,隨機分為模型組、利拉魯肽組和利拉魯肽+XAV939組,各15只。術后各組切口每天碘伏消毒2次,青霉素4 wu/次、2次/d,共3 d,避免感染。膀胱每天按摩3次,共3天以促進自然排尿功能的恢復。在脊髓損傷后的14 d內每組干預措施如下:假手術組和模型組大鼠每天皮下注射50 mg/kg生理鹽水,利拉魯肽組大鼠每天皮下注射50 μg/kg利拉魯肽, 利拉魯肽+XAV939組大鼠每天皮下注射50 μg/kg利拉魯肽和0.4 mg/kg XAV939(一種Wnt/β-catenin信號通路的小分子抑制劑)。

1.3 檢測指標

1.3.1 運動功能評分 采用BBB評分(Basso, Beattie &Bresnahan locomotor rating scale,BBB scale)對脊髓損傷大鼠干預后下肢功能恢復情況進行評估。方法如下:將大鼠置于一個寬敞的開口容器內,用近距離的方式觀察大鼠在爬行時后肢各關節的活動能力與協調性。評分范圍為0～21分,分別于術前、干預后第7天、第14天對大鼠下肢運動功能進行評估,分值較高的大鼠下肢功能恢復較好。實驗采用雙盲、兩人獨立打分法。每只大鼠重復測定3次,取平均值并記錄。

1.3.2 Western blot分析 術后干預的第14天,腹腔注射戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉大鼠,并切開T8-11脊髓。用放射免疫沉淀法裂解緩沖液中的均質組織。然后,使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,調整至2 μg/μL,并用12%分離膠分離蛋白質。隨后,蛋白質被轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。將膜置于5%脫脂奶粉中,室溫密封1 h,與一抗β-catenin、IL-6、caspase-3、TNF-α和β-actin(均為1∶1 000),在4℃慢搖床環境下孵育過夜,第2天1×TBST清洗PVDF膜3次,每次5 min,后放入二抗稀釋液稀釋的二抗(1∶5 000,武漢博士德公司)室溫慢搖床60 min,再用1×TBST清洗3次,每次5 min,用UVP凝膠電泳儀對其進行圖像處理。利用ImageJ2X軟件對蛋白質條的灰度值進行計算,并與β-actin的灰度值進行比較和分析。

1.3.3 蘇木精-伊紅染色及尼氏染色 (1)蘇木精-伊紅(Hematoxylin-eosin,HE)染色步驟:冰凍切片取自脊髓損傷中央3 mm處接近尾部的組織,厚8 μm。-80℃冰箱中移出切片,4℃的冷藏室中放置30 min,室溫下復溫20 min;切片置于染盒中,0.01 mol/L PBS溶液洗片3次,每次5 min,可見包埋劑溶解;蘇木精染色5 min,水洗。切片在1%鹽酸乙醇中浸泡5 s,用水沖洗;氨水回藍溶液洗滌5 s,用水沖洗干凈;伊紅染色30 s后用水沖洗。80%乙醇-95%乙醇-無水乙醇-無水乙醇梯度褪色10 s。二甲苯(Ⅰ)和二甲苯(Ⅱ)各浸泡5 min。中性膠密封切片,安裝切片,在光學顯微鏡下觀察。(2)尼氏染色步驟:將切片從-80℃的冰箱中移置4℃冰箱中冷藏30 min,室溫下復溫20 min;將切片置于染盒中,0.01 mol/L PBS液洗3次,每次5 min,可見到包埋劑溶解。將清洗好的切片浸于尼氏染料中,將染盒置于37℃恒溫箱中,8 min后再用去離子水清洗2次,每次10 s,采用95%乙醇洗30 s;二甲苯5 min,重復1次;切片干燥,中性樹脂封片,用無色指甲油密封蓋住蓋玻片的上端和下端,采用光學顯微鏡對其進行觀測。

2 結果

2.1 各組大鼠BBB評分的比較4組大鼠術前BBB評分比較,差異無統計學意義(P>0.05);干預后第7天、第14天時,模型組、利拉魯肽組及利拉魯肽+XAV939組的BBB評分相較于術前顯著降低,并顯著低于假手術組(P<0.05),利拉魯肽組的BBB評分顯著高于模型組和利拉魯肽+XAV939組(P<0.05),而模型組與利拉魯肽+XAV939組的BBB評分比較,差異無統計學意義(P>0.05),見表1。

表1 各組大鼠肢體運動功能的比較 分)

2.2 各組大鼠脊髓組織病理形態的比較模型組、利拉魯肽組及利拉魯肽+XAV939組大鼠脊髓前角尼氏染色陽性細胞數量明顯少于假手術組(P<0.05);與模型組和利拉魯肽+ XAV939組相比,利拉魯肽組的脊髓組織損傷較輕,組織形態較好,尼氏染色陽性細胞的數量顯著增加(P<0.05);而模型組與利拉魯肽+ XAV939組尼氏染色陽性細胞數量相比差異無統計學意義(P>0.05),見圖1。

注：A,HE染色、尼氏染色檢測各組大鼠脊髓組織病理形態及神經元死亡情況;B,脊髓前角運動神經元定量分析; ***P<0.001。

2.3 各組大鼠脊髓組織β-catenin、caspase-3、TNF-α和IL-6表達水平的比較相較于假手術組,模型組β-catenin、caspase-3、IL-6和TNF-α表達水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,利拉魯肽組β-catenin表達顯著升高,caspase-3、IL-6和TNF-α的表達顯著降低(P<0.05);與利拉魯肽組相比,利拉魯肽+XAV939組β-catenin表達顯著降低,caspase-3、IL-6和TNF-α的表達明顯升高(P<0.05),而模型組與利拉魯肽+XAV939組β-catenin、caspase-3、IL-6和TNF-α表達水平相比,差異無統計學意義(P>0.05),見圖2、3。

注： A, Western blot實驗結果; B, β-catenin蛋白表達水平; C, caspase-3蛋白表達水平; D, TNF-α蛋白表達水平; E, IL-6蛋白表達水平。 **P<0.01, ***P<0.001。

圖3 各組大鼠脊髓組織β-catenin、caspase-3、TNF-α、IL-6蛋白免疫組化染色結果

3 討論

脊髓損傷是一種具有高致殘、致畸及高死亡率特征的中樞神經系統創傷性疾病,治療難度大,嚴重危害患者的身心健康。急性脊髓損傷發生后,機體會出現神經細胞凋亡、炎癥水平上升等一系列過程,從而加重病情[9]。研究表明[10],利拉魯肽在包括脊髓損傷等神經系統疾病的治療中具有一定價值,但相關機制還未完全明確。本研究發現利拉魯肽可通過激活Wnt/β-catenin信號通路,減少神經細胞凋亡,降低炎癥因子水平,從而發揮對急性脊髓損傷大鼠的神經保護作用。

Wnt/β-catenin信號途徑在胚胎發育、腫瘤發生、細胞凋亡等方面起著關鍵的調控作用,研究表明該通路在急性脊髓損傷發生后發揮著關鍵作用[11]。賈云峰等[12]的研究顯示,甲基強的松龍可通過激活Wnt/β-catenin信號通路對大鼠急性脊髓損傷模型發揮神經保護作用。Gao等[13]的研究發現,Wnt-3a可通過激活Wnt/β-catenin信號通路對大鼠脊髓損傷后發揮神經保護作用。另一項研究也表明,HSP70可通過激活Wnt/β-catenin信號通路緩解大鼠脊髓損傷[14]。XAV939是一種高效的、能夠穿透細胞的小分子抑制劑,它能夠特異性地抑制多聚ADP核糖基化酶TNKS1和TNKS2。通過穩定axin蛋白的活性,XAV939促進了β-catenin的降解,從而破壞了Wnt信號通路[15]。在本研究中,我們的實驗也證實了在脊髓損傷大鼠中,利拉魯肽可激活Wnt/β-catenin信號通路,XAV939抑制Wnt/β-catenin信號通路。

在本實驗中,SD大鼠在脊髓損傷后給予利拉魯肽干預,結果表明,利拉魯肽治療能增加脊髓損傷大鼠的運動功能評分和脊髓前角運動神經元的數量,從而促進脊髓損傷后大鼠運動神經功能的恢復。而相較于利拉魯肽組,利拉魯肽+XAV939組大鼠的運動功能恢復情況顯著降低,并且與模型組大鼠類似。此外,脊髓損傷大鼠應用利拉魯肽干預可顯著降低凋亡相關蛋白caspase-3和炎性因子TNF-α、IL-6的表達水平。而相較于利拉魯肽組,利拉魯肽+XAV939組大鼠的caspase-3、TNF-α、IL-6顯著升高,并且與模型組大鼠類似。Zhao等[16]的研究發現,在大鼠脊髓半切模型中應用一種復合水凝膠支架后,通過激活Wnt/β-catenin信號傳導系統,可實現神經干細胞向神經元分化并促進神經細胞生長,使受損的脊髓組織得到修復。caspase-3是細胞凋亡過程中的一個關鍵酶,有研究顯示[17],在海馬脊髓損傷后caspase-3表達水平顯著上升,表明脊髓損傷可能誘導海馬的神經元凋亡。脊髓損傷會引起炎癥反應的激活,TNF-α、IL-1β、IL-18和 IL-6的升高會加重神經元炎癥和脊髓損傷[18]。本研究結果提示,急性脊髓損傷可引起細胞凋亡和炎癥反應的激活,而利拉魯肽可激活Wnt/β-catenin信號通路,使β-catenin上升,降低caspase-3、TNF-α和IL-6表達水平,發揮抑制細胞凋亡,減輕炎癥反應的作用,從而有助于脊髓損傷后的功能恢復。

綜上所述,利拉魯肽可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路調控相關蛋白的表達水平,減輕神經細胞凋亡及炎癥反應,從而對急性脊髓損傷大鼠發揮神經保護作用。