SOX7基因慢病毒載體的構建及其在缺氧條件下對HUVECs增殖與遷移功能的影響

吳逸卓, 黃俊鑫, 丁曉維, 于 昱

(上海交通大學醫學院附屬新華醫院心血管發育與再生醫學研究所, 上海 200092)

SOX轉錄因子家族在1990年由于哺乳動物Y染色體性別決定區(Sex determining region of Y,SRY)中HMG盒的高度保守性而首次被發現[1]。按照基因構成和功能可分為9個家族(A、B1、B2、C、D、E、F、G、H)[2]。其中SOX7通常在轉錄水平上參與胚胎脈管系統的發育[3]。在E7.5的小鼠胚胎中,SOX7+的細胞占內皮前體細胞中ETV2+/FLK1+/CD41-細胞的97%,說明SOX7可能是早期血管發生的重要調節因子[4]。在動脈粥樣硬化病變早期,血管內膜增厚,出現缺氧環境,血管內皮細胞功能發生改變[5],而SOX7是內皮相關轉錄因子,調控血管功能。研究顯示,SOX7突變體斑馬魚的脈管系統出現顯著的血管異位連接[6]。在高級別膠質瘤患者中,SOX7促進血管形成異常[7]。因此,SOX7與血管內皮細胞之間的聯系有待深入探索。本研究通過構建SOX7穩定表達細胞株,分析缺氧條件下SOX7對人臍靜脈內皮細胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)功能的影響,以期進一步探究SOX7對動脈粥樣硬化早期病變的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞人胚腎細胞系(293T細胞)、人臍靜脈內皮細胞系(HUVECs)、pcDNA3.1(+)-SOX7質粒、pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen慢病毒過表達載體(以下簡稱pHAGE空載體)及相關輔助質粒(psPAX2和pMD2.G)由新華醫院心血管發育與再生醫學研究所保存。

1.2 試劑與儀器NheI-HF(貨號:R3131V)、NotI-HF(貨號:R3189V)均購自美國NEB公司;無內毒素質粒小提中量試劑盒(離心柱型)(貨號:DP118-02)、無內毒素質粒大提試劑盒(離心柱型)(貨號:DP117)、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(增強型)(貨號:DP219-02)均購自天根生化科技(北京)有限公司;ClonExpress II One Step Cloning Kit(貨號:C112-01)、Ultra Gelred(貨號:GR501-AA)、ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(貨號:Q411-02)均購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;Agarose(Low EEO)(貨號:ST004Q)、BeyoPureTMLB Broth with Agar(premixed powder)(貨號:ST158)、BeyoPureTMLB Broth(premixed powder)(貨號:ST156)、Ampicillin(100 mg/mL,1 000×)(貨號:ST008)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)(貨號:A0208)、CCK-8試劑盒(貨號:C0039)、polybrene(貨號:C0351)均購自上海碧云天生物技術有限公司;高糖DMEM培養基(貨號:L110KJ)、0.25%胰酶EDTA溶液(貨號:S310KJ)購自上海源培生物科技股份有限公司;SOX7 Polyclonal antibody(貨號:23925-1-AP)、GAPDH Monoclonal antibody(貨號:60004-1-Ig)均購自武漢三鷹生物技術有限公司;Stbl3感受態細胞(新賽美生物,貨號:MC012);PEI 250000(美國,Polysciences公司,貨號:24314-2);胎牛血清(以色列,BI公司,貨號:04-001-1ACS);PrimeScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)(貨號:RR036A)、RNAiso Plus(貨號:9109)購自日本TaKaRa公司。超凈工作臺(型號:51900900)、三氣培養箱(型號:51033781)均購自美國Thermo Fisher Scientific公司;熒光顯微鏡(德國,ZEISS公司,型號:Axio Vert.A1);梯度PCR儀(型號:C1000)、熒光定量PCR儀(型號:CFX96)、垂直電泳儀(型號:1658000)、膜轉移裝置(型號:1703930)、化學發光成像儀(型號:12003154)均購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司;高速離心機(德國,Eppendorf公司,型號:5424R);多功能酶標儀(瑞士,TECAN公司,型號:spark)。

1.3 方法

1.3.1 構建SOX7過表達載體 使用限制性內切酶NheI-HF和NotI-HF雙酶切pHAGE空載體,通過瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒得到線性的載體骨架。以pcDNA3.1(+)-SOX7和pHAGE載體為模版設計引物,PCR擴增SOX7。SOX7引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列見表1。使用Clon Express II One Step Cloning Kit進行同源重組后轉化涂板。挑克隆搖菌,測序得到正確的重組載體。

表1 PCR引物序列設計

1.3.2 慢病毒包裝及濃縮使用 PEI250000進行質粒轉染。以10 cm培養皿為例,500 μL Opti-MEM無血清培養基中加入9 μg質粒(穿梭質粒∶psPAX2∶pMD2.G =3∶2∶1比例),另取500 μL Opti-MEM無血清培養基加入27 μL PEI250000(濃度為1 μg/μL),靜置5 min。將兩者混勻,繼續靜置15 min,加入培養皿。轉染后6 h換液,在48 h、72 h時取上清,使用0.45 μm濾網過濾。加入10% PEG6000混勻,4℃靜置1.5 h,每20 min上下顛倒。預冷離心機,8 000 r/min,離心10 min。去除上清,使用無血清DMEM重懸沉淀,分裝,-80℃保存備用。

1.3.3 慢病毒感染HUVEC 取對數生長期的HUVECs接種至10 cm培養皿中,置于37℃、5%CO2培養箱培養。待細胞密度達50%時,分別加入濃縮后的pHAGE慢病毒懸液和SOX7-pHAGE慢病毒懸液,各100 μL,同時各加入8 μL polybrene,感染24 h后換液。感染后48～72 h在激發波長為488 nm的熒光顯微鏡下均可觀察到綠色熒光。以上步驟重復數次,直至可觀測到綠色熒光。

1.3.4 qPCR檢測mRNA表達水平 將細胞接種至6孔板中,用RNAiso PLUS提取RNA并測定濃度。取1 μg的RNA和5 μL 5×PrimeScriptTMRT Master Mix (Perfect Real Time),DEPC水補足至10 μL,按照設定程序在PCR儀進行逆轉錄。qPCR體系:ChamQ SYBR Color qPCR Master Mix(5 μL)、10 μmol/L的Primer-F和Primer-R各0.2 μL、DEPC水(5.4 μL)、未稀釋的cDNA(1 μL),按照設定程序在PCR儀進行熒光定量。實驗重復3次。

1.3.5 免疫印跡(Western blot)檢測 蛋白表達水平將細胞接種至6孔板中,使用放射免疫沉淀蛋白裂解液提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度。使用10%聚丙烯酰胺凝膠于80 V恒壓電泳,直至溴酚藍電泳至凝膠底部,后250 mA恒流轉膜60 min。室溫,5%BSA溶液封閉75 min,TBST洗膜5 min×3次,加入一抗,4℃孵育14～16 h,第二天使用TBST洗膜5 min×3次,加入二抗,室溫孵育1 h。繼續使用TBST洗膜5 min×3次后,進行化學發光。

1.3.6 細胞劃痕實驗 取對數生長期的HUVECs,用胰酶(0.25%)37℃消化,對細胞懸液進行計數,并稀釋至2.5×105個/mL。在6孔板每孔中接種2 mL細胞懸液,置于37℃、5%CO2培養箱培養過夜,使細胞密度達100%。次日,使用同一槍頭在培養皿底部劃痕,PBS洗4次,清除漂浮細胞,加入無血清DMEM,分別置于37℃、5%CO2和37℃、5%CO2、1%O2培養箱培養,0、24 h拍照記錄。劃痕結果用Image J軟件進行分析。實驗重復3次。

1.3.7 CCK-8細胞增殖實驗 根據梁慧敏等[8]的研究結果,本研究以48 h為節點研究缺氧條件下SOX7對HUVECs增殖功能的影響。取對數生長期的HUVECs,用胰酶(0.25%)37℃消化,對細胞懸液進行計數后稀釋至2×104個/mL,96孔板每孔接種100 μL,分別置于37℃、5%CO2和37℃、5%CO2、1%O2培養箱培養48 h。去除原培養液,PBS清洗,加入100 μL含10%CCK-8溶液的完全培養基,在原培養條件下繼續孵育1 h。使用酶標儀于450 nm處測定吸光度值。實驗重復3次。

2 結果

2.1SOX7重組慢病毒載體的構建通過對PCR擴增獲得產物進行電泳,可看到長度分別為7 724 bp的載體片段條帶和1 167 bp的SOX7基因條帶,見圖1。SOX7-pHAGE重組質粒的DNA測序結果證實,SOX7基因成功插入至限制性內切酶NotI位點(GCGGCCGC)和NheI位點(GCTAGC)之間,見圖2、3。

注： A, pHAGE空載體雙酶切產物膠圖; B, PCR擴增產物膠圖。

圖2 SOX7-pHAGE重組質粒圖譜

圖3 SOX7-pHAGE重組質粒的DNA測序峰圖

2.2SOX7重組慢病毒載體mRNA和蛋白表達的驗證與pHAGE空載體的SOX7比較,SOX7- pHAGE重組質粒在mRNA水平上顯著升高約111.4倍(P=0.002 8),在蛋白質水平上出現過表達條帶。空載體未檢測出條帶,而SOX7- pHAGE重組質粒檢測到清晰條帶,見圖4。

注:A,qPCR檢測SOX7 mRNA表達量統計圖; B, Western blot檢測SOX7蛋白表達電泳圖

2.3 構建SOX7穩定感染細胞株在激發波長為488 nm處的熒光顯微鏡下可觀察到SOX7穩定感染細胞株發出綠色熒光,見圖5。qPCR和Western blot結果顯示,SOX7穩定感染細胞株中SOX7在mRNA水平上顯著升高68.2倍(P=0.003 0),在蛋白水平上顯著升高1.7倍(P=0.004 3),SOX7穩定感染細胞系構建成功,見圖6。

圖5 慢病毒感染HUVECs后的熒光表達結果(40×)

注：A,qPCR檢測SOX7 mRNA表達量統計圖; B,Western blot檢測SOX7蛋白表達電泳圖;與空載體穩定感染細胞株比較,P=0.003 0,P=0.004 3。

2.4 缺氧條件下SOX7對HUVECs遷移的影響細胞劃痕實驗結果顯示,在缺氧條件下,空載體穩定感染細胞株的遷移能力降低至常氧條件的0.88倍(P=0.007 6),而SOX7穩定感染細胞株則可改善細胞的遷移能力,使其增強約1.2倍(P=0.004 4)。在常氧條件下,空載體穩定感染細胞株與SOX7穩定感染細胞株對遷移能力無影響(P>0.999 9),見圖7。

注:A-B,細胞劃痕實驗結果圖;與pHAGE空載體比較,P=0.007 6, P=0.004 4。

2.5 缺氧條件下SOX7對HUVECs增殖的影響在缺氧條件下,空載體穩定感染細胞株的增殖能力減弱至常氧水平的0.7倍(P=0.007 6),而SOX7穩定感染細胞株可以回補細胞增殖能力,使增殖能力增強1.4倍(P=0.022 8)。在常氧條件下,SOX7穩定感染細胞株可促進細胞增殖,與空載體穩定感染細胞株比較增加1.3倍(P=0.008 7),見圖8。

圖8 SOX7對HUVECs增殖的影響

3 討論

SOX7定位于8p23.1,在各類生物的基因組中具有高度保守性[9]。除調控血管發育和維持血管功能外,SOX7在其他領域中也有許多重要的發現。在乳腺癌[10]、前列腺癌[11]中SOX7表達水平下調,可作為腫瘤抑制因子及重要的腫瘤標志物。在人肺癌相關細胞系和乳腺癌細胞系中,SOX7通過上調P38和凋亡途徑相關的基因來誘導細胞凋亡,同時SOX7也可抑制泛素-蛋白酶體系統中促凋亡蛋白的降解[12]。除此之外,SOX7在胚胎發育(特別是心血管系統的發育)中也具有重要作用。有研究顯示,SOX7單倍體功能不全導致先天性膈疝發生,而缺失SOX7的第二外顯子后胚胎在膈肌發育前死亡,并伴有心包囊擴張和卵黃囊異常重塑[13]。小鼠胚胎從E7.5發育至E10.5,胚胎出現了廣泛的血管發育異常[14]。在心內膜內皮細胞中特異性敲除SOX7使心內膜墊發育不良,引起房室間隔缺損[15]。SOX7也促進心肌致密化,參與冠狀動脈發育[16]。

本研究通過構建SOX7-pHAGE重組質粒和SOX7穩定感染細胞株,為研究動脈粥樣硬化中SOX7調控內皮細胞功能提供了理論基礎。在肺癌細胞中,過表達SOX7后細胞的遷移和增殖能力減低[17],而在乳腺癌細胞中,缺失SOX7后細胞的遷移和增殖能力增加[10]。SOX7在不同腫瘤細胞中可抑制細胞增殖和遷移能力,但涉及內皮細胞尤其是缺氧造模的疾病模型下的相關研究鮮見報道。因此,本研究重點關注SOX7對缺氧情況下血管內皮細胞的增殖與遷移能力的影響。結果顯示,在常氧條件下,SOX7穩定感染細胞株對其遷移能力沒有影響,但促進了細胞增殖能力。這與Xu等[10]的研究結果一致。而在缺氧條件下,SOX7穩定感染細胞株可有效回補HUVECs的遷移和增殖能力,改善血管功能。

綜上所述,本研究構建了SOX7- pHAGE重組質粒和SOX7穩定感染細胞株。發現在常氧條件下,SOX7穩定感染細胞株可促進HUVECs的增殖能力;在缺氧條件下,SOX7穩定感染細胞株可回補HUVECs被抑制的遷移和增殖能力,這為研究SOX7在內皮細胞中的功能提供了細胞層面的依據。但本研究僅限于體外細胞實驗,對SOX7在動脈粥樣硬化發生發展中的作用及分子機制仍需進行深入的細胞和動物實驗。