模擬炎癥微環境下紫草素對人牙周膜干細胞增殖和成骨分化的影響

陳意磊, 于 倩,2, 張文杰, 趙 今,2

(1新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院)牙體牙髓病科; 2新疆維吾爾自治區口腔醫學研究所, 烏魯木齊 830054)

慢性牙周炎是發生于牙周支持組織不可逆轉的慢性炎癥性疾病,可導致牙槽骨吸收、牙齒脫落等不良癥狀[1]。目前臨床上常用的治療方法是機械清除牙結石,局部使用抗菌藥物輔助治療[2]。對于已喪失牙周組織的患者,使用傳統的治療方法并不能實現穩定的牙周組織再生[3]。人牙周膜干細胞(Human periodontal ligament stem cells, hPDLSCs)具有高可塑性和多潛能性等特點成為牙周炎患者牙周組織和骨再生的理想候選細胞,對牙周治療具有重要意義[4-6]。有研究表明炎癥環境可抑制hPDLSCs的增殖和成骨分化[7],牙周組織再生也就受到抑制,因此需要探尋一種有效的策略增強炎癥環境下hPDLSCs的成骨分化能力。天然藥物輔助治療牙周炎具有一定的優勢[8],例如巴戟天多糖能在炎癥環境下使牙周膜細胞乙?；?表達降低,核苷酸結合寡聚化結構域(Nucleotide Binding Oligomerization Domain, NOD)樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3表達升高,發揮抗炎作用[9]。趙斌等[10]研究發現蘆丁在炎癥環境下能夠促進hPDLSCs成骨分化。紫草素是從紫草中提取的一種萘醌類活性成分,具有抗菌消炎、抗氧化、抗病毒、抗腫瘤等作用[11-14]。本課題組前期研究發現紫草素可通過骨保護素/核因子κB受體活化因子配體信號軸促進小鼠成骨前體細胞細胞增殖和成骨分化,還可通過抑制破骨相關基因的表達,從而抑制破骨細胞生成[15-16]。本研究在脂多糖誘導炎癥微環境下探究紫草素對hPDLSCs增殖與成骨分化的影響,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 試藥紫草素(上海源葉生物科技有限公司,B21682); α-MEM培養基(美國Gibco公司,C12571500BT);磷酸鹽緩沖溶液(Phosphate buffer saline, PBS,美國Cytiva公司,02-024-1ACS);青鏈霉素(美國BI公司,03-031-1B);胰蛋白酶(美國BI公司,03-050-1B);胎牛血清(美國BI公司,04-001-1ACS);二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO,(北京索萊寶生物科技有限公司,D8371);牙齦卟啉單胞菌脂多糖(英國InvivoGen公司,LPG-41-01);CD29(美國Biolegend公司,303021);CD105(美國Biolegend公司,323217);CD34(美國Biolegend公司,343515);CD45(美國Biolegend公司,368508);細胞增殖毒性檢測試劑盒CCK-8(英國Proteintech公司,PF00004-500T);牙周膜干細胞成骨誘導分化試劑盒、茜素紅(美國Cyagen公司,HUXXC-90021); ALP染色試劑盒(碧云天生物技術有限公司,C3206);BCA蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術有限公司,P0010-500);ALP活性測試盒(南京建成生物工程研究所,A059-2);Trizol(invitrogen公司,15596-026);cDNA合成試劑盒(英國Thermo Fisher Scientific公司,4368814);RT-PCR試劑盒(Takara公司,RR820A);引物(生工生物工程有限公司,SGYW020)。

1.2 儀器MINI-10K型迷你離心機(杭州佑寧儀器有限公司);VORTEX-6型混勻儀(其林貝爾儀器制造有限公司);XS1003S型電子天平(METTLER TOLEDO);SW-CJ-2F型超凈工作臺(博迅實業有限公司);CytoFLEX型流式細胞儀(貝克曼庫爾特公司);DM IL LED型倒置顯微鏡(德國徠卡公司);BC-J160型二氧化碳細胞培養箱(博迅醫療生物儀器有限公司);CHT210R型高速冷凍離心機(湖南湘儀實驗儀器有限公司);Multiskan型GO全波長酶標儀(賽默飛世爾公司);A51683型實時熒光定量PCR儀(賽默飛世爾公司);Forma 88500型-80℃冰箱(賽默飛世爾公司)。

1.3 方法

1.3.1 hPDLSCs的分離和培養 收集2023年3月-5月就診于新疆醫科大學第一附屬醫院(附屬口腔醫院口腔外科門診)因正畸需拔除的前磨牙或智齒(12～25歲牙周健康者),將離體牙保存到預冷的α-MEM完全培養基(含10%胎牛血清,1%青鏈霉素,89% α-MEM基礎培養基)中,30 min內送至實驗室。在超凈臺內,用α-MEM完全培養基反復沖洗牙根直至無血漬,用12號刀片小心刮取根中1/3牙周膜,剪成1 mm3的組織塊,收集于離心管中,1 000 r/min離心3 min,此過程重復3次,將組織塊置于培養瓶底部,翻轉培養瓶,加入3 mL α-MEM完全培養基,置于37℃、5% CO2環境下干涸2 h,翻轉培養瓶孵育。培養基3 d更換1次,待細胞鋪滿瓶底70%～90%時,用0.25%胰蛋白酶消化,按1∶3傳代,標記為第1代細胞(P1)。取P3-P5代用作后續實驗。本研究通過新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會的審批(審批號:K202304-19),所有研究對象均簽署知情同意書。

1.3.2 藥物配置 將14.42 mg紫草素粉末溶于1 mL DMSO中,混勻后用0.22 nm濾器過濾得到5×104μmol/L的紫草素母液,分裝于EP管中,置于液氮罐保存。實驗時稀釋母液分別至4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 μmol/L。

1.3.3 hPDLSCs鑒定 取狀態良好的P3代細胞采用流式細胞檢測儀檢測細胞的表面標志物,其中陽性標志物CD105、CD29,陰性標志物CD34、CD45。

1.3.4 CCK-8檢測 紫草素對不同狀態hPDLSCs的增殖影響實驗分組:空白組(單純培養基)、不同濃度紫草素組( 0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4 μmol/L),每孔加入200 μL。每孔2×103個細胞,每組4個復孔,按照分組連續培養7 d,分別在1、3、5、7 d使用CCK-8試劑盒測量吸光度值。根據測定結果,選用對hPDLSCs有促進增殖作用的紫草素濃度范圍,進行分組:空白組(單純培養基)、LPS組(Porphyromonasgingivalislipopolysaccharide,P.g-LPS ,10 μg/mL)、LPS+不同濃度紫草素組(P.g-LPS+不同濃度紫草素),每孔加入200 μL,每孔2×103個細胞,每組4個復孔。體外模擬炎癥微環境選用牙齦卟啉單胞菌脂多糖(P.g-LPS),濃度為10 μg/mL,LPS預先誘導,添加紫草素,連續培養72 h,分別在24、48、72 h時按CCK-8試劑盒說明書操作,用酶標儀測定450 nm處吸光度。

1.3.5 分組 根據“1.3.4”項下實驗結果,選取后續實驗最佳紫草素濃度進行實驗分組:空白組(單純培養基)、紫草素組(實驗藥物濃度紫草素)、LPS組(P.g-LPS ,10 μg/mL)、紫草素+LPS組(P.g-LPS+實驗藥物濃度紫草素,先加入P.g-LPS誘導炎癥微環境,后加入實驗藥物濃度的紫草素)。

1.3.6 劃痕實驗 按“1.3.5”項下方法分組,將hPDLSCs以5×104個/孔的密度接種于12孔板中,待細胞融合至80%時,用200 μL移液槍槍頭在孔板底部劃一均勻橫線,每組3個復孔,分別在0、24 h在倒置顯微鏡下測量劃痕寬度,用Image J軟件計算遷移率,遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度/0 h劃痕寬度)×100%。

1.3.7 細胞上清液中IL-6、IL-18的測定 將hPDLSCs以3×104個/孔的密度接種于24孔板中,待細胞融合至80%時,按“1.3.5”項下分組方法更換培養基進行培養,每組3個復孔,培養72 h后收集于離心管中,4 000 r/min離心20 min,取上清液,-80℃保存。按ELISA試劑盒說明書方法檢測上清液中IL-6、IL-18的水平。

1.3.8 堿性磷酸酶染色 將hPDLSCs以2×105個/孔的密度接種于6孔板中,待細胞融合至80%時,按“1.3.5”項下分組方法更換成品成骨誘導培養基進行培養,每組3個復孔。培養7 d后進行堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)染色,顯微鏡下觀察并拍照記錄。

1.3.9 ALP活性檢測 將hPDLSCs以3×104個/孔的密度接種于24孔板中,待細胞融合至80%時,按“1.3.5”項下分組方法更換成骨誘導培養基,每組3個復孔,7 d后終止培養,裂解細胞后1 000 r/min離心10 min上清為待測樣本。按BCA蛋白試劑盒說明書操作,測定標準曲線以計算各組蛋白濃度。按照ALP活性測試盒說明書操作,在96孔板中進行分組:空白孔、標準孔、測定孔,用酶標儀測定520 nm處各孔吸光度,細胞ALP活力=(測定孔OD值-空白孔OD值)/標準孔OD值-空白孔OD值×標準品濃度(0.02 mg/mL)÷待測樣本蛋白濃度。

1.3.10 茜素紅染色 將hPDLSCs以5×105個/孔的密度接種于35 mm培養皿中,待細胞融合至80%時,按“1.3.5”項下方法分組更換成骨誘導培養基進行培養,每組3個復孔。培養21 d后終止,進行茜素紅染色,顯微鏡下觀察并拍照記錄,Image J軟件計算結節相對含量,礦化結節相對含量=紫草素組礦化結節數/空白組礦化結節數×100%。

1.3.11 RT-PCR檢測基因表達 按“1.3.9”項下方法培養hPDLSCs,每組3個復孔,培養7 d后終止,采用Trizol法提取總RNA,定量后用反轉錄試劑盒逆轉錄為cDNA。在實時定量熒光PCR儀上進行擴增,以GAPDH 為內參。RT-PCR 反應條件:(1)預變性95℃,2 min;(2)變性95℃,5 s;(3)退火58℃,30 s,共40個循環;(4)延伸72℃,5 min。用2-△△Ct相對定量法檢測檢測骨鈣素(Osteocalcin, OCN)、RUNT相關轉錄因子2(Runt-related transcription factor 2, RUNX2)、ALP mRNA的表達,引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物

2 結果

2.1 hPDLSCs形態學與鑒定組織塊法分離培養原代hPDLSCs,培養120 h后可見組織塊周圍有長梭形細胞爬出,呈漩渦狀生長(圖1)。流式細胞儀檢測hPDLSCs表面標志物結果顯示:CD29(99.91%)、CD105(92.34%)、CD34(0.76%)、CD45(0.32%),證實分離細胞符合干細胞特性,見圖2。

注： 圖1A為原代hPDLSCs; 圖1B為P3代hPDLSCs; 標尺大小: 100 μm。

圖2 hPDLSCs表面標志物CD105、CD29、CD45、CD34結果圖

2.2 紫草素對hPDLSCs增殖的影響CCK-8結果顯示:與對照組相比,在1 d時各濃度紫草素組細胞增殖能力差異無統計學意義(P>0.05),見圖3A;在3、 5、 7 d時, 當紫草素濃度大于1 μmol/L時,隨著紫草素濃度增加,對細胞有抑制作用,當紫草素濃度在0.062 5～0.5 μmol/L范圍時對hPDLSCs有促進增殖作用,差異有統計學意義(P<0.05),見圖3B-D。模擬炎癥微環境下:在24、48、72 h時,與對照組相比,LPS組有抑制細胞增殖的作用;與LPS組相比, 0.062 5～0.5 μmol/L濃度的紫草素+LPS組促進hPDLSCs增殖的作用, 且0.5 μmol/L濃度的紫草素作用最佳,差異有統計學意義(P<0.05),見圖4。結合紫草素對hPDLSCs增殖活性的結果,后續實驗選擇0.5 μmol/L的藥物濃度。

注：圖3A為1 d結果,圖3B為3 d結果,圖3C為5 d結果,圖3D為7 d結果。與空白組比較, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001。

注: 圖4A為1 d結果; 圖4B為2 d結果; 圖4C為3 d結果; 與LPS組比較, **P<0.01, ***P<0.001。

2.3 細胞劃痕實驗與空白組相比,LPS組細胞遷移率減小,紫草素細胞遷移率增加,差異有統計學意義(P<0.05);與LPS組相比,紫草素+LPS組細胞遷移率增加,差異有統計學意義(P<0.05),見圖5、6。

圖5 各組不同時間細胞劃痕結果顯微圖(×40)

注:與空白組比較, ***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

2.4 細胞上清液中IL-6、IL-18的水平的測定與空白組相比,LPS組中IL-6、IL-18水平升高,差異有統計學意義(P<0.05);與LPS組相比,紫草素+LPS組中IL-6、IL-18水平降低,差異有統計學意義(P<0.05),如圖7、8。

注:與空白組比較,***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

注:與空白組比較,***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

2.5 紫草素對模擬炎癥環境下hPDLSCs的ALP活性的影響成骨誘導21 d后,與空白組相比,LPS組的染色深度明顯降低,紫草素組的染色深度增加;與LPS組相比,紫草素+LPS組的染色深度加深。如圖9、10。

注:與空白組比較,***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

注：堿性磷酸酶染色顯微鏡下圖(×40),標尺大小:100 μm。

2.6 紫草素對模擬炎癥環境下hPDLSCs礦化作用的影響成骨誘導504 h后,與空白組相比,LPS組的礦化結節數減少,紫草素組的礦化結節數量增加且染色較深;與LPS組相比,紫草素+LPS組的礦化結節數量明顯增加。如圖11、12。

注：茜素紅染色鏡下圖(×40),標尺大小:100 μm。

注:與空白組比較, ***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

2.7 紫草素對模擬炎癥環境下hPDLSCs中OCN、RUNX2、ALP表達的影響RT-PCR結果顯示:與空白組相比,LPS組中OCN、RUNX2、ALP表達降低,而紫草素組OCN、RUNX2、ALP表達增加,差異有統計學意義(P<0.05);與LPS組相比,紫草素+LPS組中OCN、RUNX2、ALP表達增加,差異有統計學意義(P<0.05),如圖13、14、15。

注:與空白組比較, ***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

注:與空白組比較, ***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

注:與空白組比較, ***P<0.001; 與LPS組比較, ###P<0.001。

3 討論

牙周病的發生涉及一系列免疫炎癥反應,炎癥微環境會抑制牙周細胞成骨成血管反應,影響牙周組織的再生[17]。hPDLSCs是一種牙源性間充質干細胞,在牙周組織重建和骨再生中發揮重要作用[18]。研究發現炎癥會抑制牙周組織的再生,紫草素具有明顯的抗炎活性[19],能下調由脂多糖刺激的Toll樣受體4的表達水平,抑制IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌,并促進IL-10的分泌[20]。本課題組研究表明,紫草素對牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌均有抑菌作用,并且可以減輕實驗性小鼠牙周炎的炎癥反應,抑制牙槽骨的吸收及破骨細胞的生成[21]。

本研究通過P.g-LPS刺激模擬體外炎癥微環境[22],與TNF-α誘導結果相同,發現LPS能明顯抑制hPDLSCs的增殖,說明LPS能成功模擬炎癥微環境。利用CCK-8篩選出對hPDLSCs沒有毒性且具有增殖作用的紫草素濃度范圍后,在炎癥微環境下篩選出增殖作用最佳的紫草素濃度為0.5 μmol/L。劃痕實驗能模擬細胞的愈合能力[23],本實驗結果證明0.5 μmol/L濃度的紫草素能在炎癥環境下促進細胞的遷移。牙周炎發生時IL-6可以使中性粒細胞激活,加劇炎癥反應,還促使血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor, VEGF)的生成,進而促進新生血管形成導致炎癥反應的加劇[24]。IL-18可以誘導趨化因子、基質金屬蛋白酶9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的釋放[25],導致組織降解,還能促進炎癥細胞的吞噬、抗感染,誘導慢性牙周炎癥急性期蛋白的合成[26]。ELISA結果顯示,對比空白組,LPS組的上清液中IL-6、IL-18水平升高,證明促炎成功。0.5μmol/L濃度的紫草素能夠降低IL-6、IL-18水平,說明0.5 μmol/L濃度的紫草素具有明顯的抗炎作用,這與前期研究結果一致[27]。

牙周組織再生最重要的是能否成骨,堿性磷酸酶染色和茜素紅染色是觀察成骨的標志性方法[28-29]。經成骨誘導后,ALP染色及活性測試和茜素紅染色結果顯示,LPS能夠明顯抑制hPDLSCs的成骨分化,說明炎癥環境能抑制成骨分化。而0.5 μmol/L濃度的紫草素能夠明顯促進成骨分化,在炎癥環境下也能促進成骨分化,這與課題組前期研究結果一致。說明0.5 μmol/L濃度的紫草素在正常環境及炎癥環境下,均具有促進hPDLSCs成骨分化的作用。RNUX2作為一種骨形成的關鍵調節因子,能夠調節一系列基因的表達,不僅能促進成骨細胞的增殖分化,還參與骨重塑和骨修復等過程[30]。OCN是一種鈣化組織的非膠原基質蛋白,是一種明確的成骨細胞標志物與膠原蛋白和磷灰石結合,在骨吸收和礦化中發揮作用[31]。OCN、ALP是晚期骨形成和成骨細胞分化的成骨標志物[32]。本實驗RT-PCR結果表明,0.5 μmol/L濃度的紫草素在正常及炎癥微環境中均能不同程度的促進RUNX2、OCN和ALP的基因表達。但紫草素在炎癥環境下促進hPDLSCs成骨分化的具體機制還有待進一步研究。

綜上所述,適當濃度的紫草素在炎癥環境下能夠促進hPDLSCs的增殖和成骨分化,可作為慢性牙周炎防治的潛在備選藥物。由于口腔是個復雜的環境,本課題組將進一步探究炎癥微環境下紫草素對牙周組織再生的影響及機制,以期為牙周病的防治提供實驗基礎。