miR-152-3p通過AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路促進腦出血大鼠神經(jīng)元鐵死亡

汪赟輝，張笑鋒

德清縣人民醫(yī)院（浙江大學(xué)附屬邵逸夫醫(yī)院德清院區(qū)） 神經(jīng)外科，浙江 湖州 313200

腦出血（intracerebral hemorrhage, ICH）作為神經(jīng)外科急癥，是由慢性高血壓或動脈粥樣硬化導(dǎo)致腦內(nèi)小微血管破裂引起的神經(jīng)損傷性疾病[1]。雖然ICH僅占腦卒中的10%～15%，但其能夠加劇導(dǎo)致腦卒中患者的死亡和殘疾。該疾病因其住院治療周期長，預(yù)后不佳，并發(fā)癥多等特點，消耗大量醫(yī)療資源[2]。目前研究表明，ICH的致病機制大致是由于腦血腫壓迫腦組織，并在其融解的過程中大量釋放凝血酶、鐵離子等毒性物質(zhì)及活性氧自由基和炎癥因子，引發(fā)細(xì)胞毒性腦水腫。腦水腫是ICH后繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素，是造成患者神經(jīng)功能缺損的主要原因[3]，其主要因素可能是由于腦水腫導(dǎo)致壓迫腦神經(jīng)細(xì)胞，進而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[4-5]。有研究稱ICH后神經(jīng)細(xì)胞處于缺血缺氧狀態(tài)，并表現(xiàn)出多種細(xì)胞死亡形式[6]。鐵死亡的實質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物代謝障礙，在鐵離子催化作用下代謝發(fā)生異常，當(dāng)細(xì)胞抗氧化能力減弱，脂質(zhì)活性氧堆積，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[7]。鐵作為血腫降解的主要活性產(chǎn)物，可通過多種途徑導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[8]。因此，明確ICH后神經(jīng)細(xì)胞死亡機制，在病程中采取相應(yīng)干預(yù)措施抑制神經(jīng)細(xì)胞鐵死亡是減輕繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵。MicroRNAs （miRNAs）在調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)過程中起著重要作用[9]。相關(guān)的研究結(jié)果表明miRNA在ICH的發(fā)病中具有重要的調(diào)控作用[10]，在大鼠ICH模型中抑制miR-let-7c的表達(dá)則能夠減少細(xì)胞死亡和細(xì)胞水腫，起到神經(jīng)保護[11]，相關(guān)研究[12-14]還發(fā)現(xiàn)腦出血患者血漿中miR-150、miR-365、miR-30c、miR-27a、miR-574-5p、miR-130a及miR-423均出現(xiàn)了異常表達(dá)。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-152-3p在體外誘導(dǎo)ICH的神經(jīng)元中顯著上調(diào)。因此，我們推測miR-152-3p很有可能參與ICH的發(fā)生與發(fā)展。本研究通過體外細(xì)胞實驗探討抑制miR-152-3p表達(dá)后對ICH導(dǎo)致的體外神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的改善作用，以及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞（KMCC-002-137，上海昆盟生物科技有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（北京索萊寶公司）；FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒（南京凱基生物科技公司）；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS，杭州天杭生物科技公司）；LipofectamineTM2000試劑盒和TRIzol試劑（美國Invitrogen公司）；引物序列、miR-152-3p inhibitor（si-RNA，南京凱基生物科技公司設(shè)計合成）；PIK3CA抑制劑（LY294002，美國Sigama公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒（南京凱基生物科技有限公司）；兔抗鼠磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha isoform, PIK3CA）、磷酸化蛋白激酶B（phosprotein kinase B, p-AKT）、蛋白激酶B（protein kinase B, AKT）、糖原合酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β）、核因子紅系2相關(guān)因子2（nuclear factor-erythroid 2 related factor2, Nrf2）和GAPDH多克隆抗體（英國Abcam公司）；RIPA試劑和化學(xué)發(fā)光試劑（南京凱基生物科技公司）；氧合血紅蛋白（oxyhemoglobin，oxyHb，上海西格生物科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞復(fù)蘇后，使用DMEM培養(yǎng)基（含有10%的FBS）進行培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的大鼠腦皮層神經(jīng)元細(xì)胞接種在6孔板中（0.5×106個/孔），使用LipofectamineTM2000將miR-152-3p inhbitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，轉(zhuǎn)染完成后6 h，更換培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.2 細(xì)胞分組及處理 細(xì)胞分為對照組、模型組、miR-152-3p inhibitor組和miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組。對照組細(xì)胞給予常規(guī)培養(yǎng)；模型組細(xì)胞參照相關(guān)文獻[15-16]，以 10 μmol/L oxyHb刺激大鼠神經(jīng)元細(xì)胞6 h構(gòu)建ICH體外細(xì)胞模型；miR-152-3p inhibitor組細(xì)胞在將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，構(gòu)建ICH體外細(xì)胞模型；miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組細(xì)胞在將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，構(gòu)建ICH體外細(xì)胞模型并給予10 nmol/L PIK3CA抑制劑處理。各組細(xì)胞給予相應(yīng)處理48 h后，收集各組細(xì)胞進行后續(xù)實驗。每個實驗均重復(fù)3次。

1.2.3 RT-qPCR檢測 各組細(xì)胞分別給予相應(yīng)處理48 h后，離心收集細(xì)胞后，用PBS清洗2次后，使用TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，行PCR擴增。引物序列見表1，miR-152-3p以U6為內(nèi)參，其他基因以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算相應(yīng)基因的相對表達(dá)量。

表1 相關(guān)基因引物序列

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，PBS清洗2次后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5.0×104個/mL。取細(xì)胞懸液1.0 mL，離心（1 000×g，5 min），去除上清液后，加入500 μL的結(jié)合緩沖液將細(xì)胞重新置懸，將10 μLAnnexin V-FITC和5 μL的PI加入試管內(nèi)，10 min內(nèi)上機（美國Thermo Fisher公司）檢測細(xì)胞凋亡狀況。

1.2.5 免疫熒光檢測 收集各組細(xì)胞，用中性甲醛溶液固定10 min后，使用TBS清洗2次后，滴加封閉緩沖液在37 ℃的濕盒中進行30 min的孵育；使用0.2% Triton X-100在室溫的條件下進行5 min的通透，使用非特異性抗原進行20 min的封閉，加入Nrf2抗體在37 ℃的條件下行2 h的孵育，使用PBS進行清洗，在37 ℃的條件下使用Goat Anti-Mouse IgG H＆L（Alexa Fluor?647）二抗進行30 min的孵育，使用PBS清洗干凈后，滴加DAPI避光5 min的孵育，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.6 Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá) 收集各組細(xì)胞，使用RIPA試劑提取總蛋白，采用BCA法檢測蛋白量，使用10% SDS-PAGE進行電泳，電泳完成后，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用5%的脫脂奶粉溶液進行1 h的封閉。分別滴加SLC7A44、GPx4、PIK3CA、p-AKT、AKT、GSK-3β、Nrf2和GAPDH一抗在4 ℃環(huán)境中孵育過夜，次日，用流水清洗干凈后，滴加辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（1:200）在37 ℃的環(huán)境下行1 h的孵育。再加入化學(xué)發(fā)光試劑避光顯影，曝光，以GAPDH為內(nèi)參，使用Image J圖像分析軟件進行蛋白條帶灰度值分析。

1.2.7 雙熒光素酶靶標(biāo)實驗 構(gòu)建PIK3CA野生型熒光素酶報告基因載體（PIK3CA-wt），同時構(gòu)建PI3ACA突變型熒光素酶報告基因載體（PIK3CAmut），此過程由南京凱基生物科技有限公司完成。將大鼠神經(jīng)元細(xì)胞（1×105個/孔）接種至6孔板中，將PIK3CA-mut與miR-152-3p mimics、PIK3CA-mut與miR-NC、PIK3CA-wt與miR-152-3p mimics、PIK3CAwt與miR-NC使用LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染完成6 h后。根據(jù)雙熒光素酶靶標(biāo)實驗試劑盒操作步驟進行檢測，以熒光強度表示細(xì)胞熒光酶活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法

采用SPSS26.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料均符合正態(tài)分布，以±s表示，2組比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-152-3p靶向調(diào)控PIK3CA及相關(guān)基因表達(dá)

生物信息學(xué)軟件預(yù)測（圖1A）結(jié)果顯示，miR-152-3p可靶向性調(diào)控PIK3CA，與共轉(zhuǎn)染PIK3CA-wt與miR-NC的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染PIK3CA-wt與miR-152-3p的細(xì)胞熒光素酶活性受到顯著抑制（P＜0.01）；與共轉(zhuǎn)染PIK3CA-mut與miR-NC的細(xì)胞相比，共轉(zhuǎn)染PIK3CA-mut與miR-152-3p的細(xì)胞熒光素酶活性差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1B。RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與miR-NC組比，miR-mimics中miR-152-3p基因表達(dá)水平顯著升高，而PIK3CA基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01，圖1C、圖1D）。

圖1 miR-152-3p靶向調(diào)控PIK3CA及相關(guān)基因表達(dá)

2.2 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

與對照組（5.16%±2.51%）比，模型組細(xì)胞凋亡率（25.84%±4.76%）明顯增高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率（6.33%±3.45%）顯著降低（P＜0.01），見圖2。

圖2 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響

2.3 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示，與對照組比，模型組miR-152-3p和GSK-3β基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2 基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組miR-152-3p和GSK-3β基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的影響（±s）

2.4 miR-152-3p inhibitor對鐵死亡相關(guān)蛋白的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比，模型組SLC7A11和GPx4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），與模型組比，miR-152-3p inhibitor組SLC7A11和GPx4蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），見圖3。

圖3 miR-152-3p inhibitor對鐵死亡相關(guān)蛋白的影響

2.5 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示，與對照組比，模型組GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2 蛋白表達(dá)水平及p-AKT/AKT顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，與模型組相比，miR-152-3p inhibitor組GSK-3β蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2蛋白表達(dá)水平及p-AKT/AKT顯著升高（P＜0.01）。見圖4和表3。

圖4 miR-152-3p inhibitor對oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

表3 miR-152-3p對PIK3CA、GSK-3β和Nrf2蛋白水平以及p-AKT/AKT的影響（±s）

2.6 miR-152-3p對Nrf2入核的影響

與正常組Nrf2蛋白入核率（90.51%±4.32%）相比，模型組Nrf2蛋白入核率（10.43%±3.19%）顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，與模型組相比，miR-152-3p inhibitor組Nrf2蛋白入核率（84.79%±6.51%）顯著升高（P＜0.01）。見圖5。

圖5 miR-152-3p對Nrf2入核的影響（×400）

2.7 PIK3CA抑制劑對miR-152-3p inhibitor改善細(xì)胞凋亡的影響

與模型組（25.76%±4.51%）相比，miR-152-3p inhibitor組細(xì)胞凋亡率（5.19%±3.18%）顯著降低（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并使用PIK3CA抑制劑干預(yù)后，與miR-152-3p inhibitor組相比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組細(xì)胞凋亡率（20.33%±4.72%）顯著增加（P＜0.01）。見圖6。

圖6 PIK3CA抑制劑對miR-152-3p inhibitor改善細(xì)胞凋亡的影響

2.8 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關(guān)基因表達(dá)中的作用

RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與模型組相比，miR-152-3p inhibitor和miR-152-3p+PIK3CA抑制劑組miR-152-3p基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），miR-152-3p inhibitor組GSK-3β基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2 基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后使用PIK3CA抑制劑干預(yù)后，與miR-152-3p inhbitor組相比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組GSK-3β基因表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA、AKT和Nrf2 基因表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關(guān)基因表達(dá)中的作用（±s）

2.9 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關(guān)蛋白表達(dá)中的作用

Western blot結(jié)果顯示，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2 蛋白表達(dá)水平以及p-AKT/AKT比率顯著升高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并給予PIK3CA抑制劑處理后，與miR-152-3p inhibitor組相比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組GSK3β蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），PIK3CA和Nrf2蛋白表達(dá)水平以及p-AKT/AKT比率顯著降低（P＜0.01）。見圖7和表5。

圖7 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關(guān)蛋白表達(dá)中的作用

表5 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p inhibitor影響的相關(guān)蛋白表達(dá)中的作用（±s）

2.10 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響鐵死亡相關(guān)蛋白中的作用

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與模型組比，miR-152-3p inhibitor組SLC7A11 和GPx4 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；將miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并給予PIK3CA抑制劑處理后，與miR-152-3p inhibitor組比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組SLC7A11和GPx4蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01），見圖8。

圖8 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響鐵死亡相關(guān)蛋白中的作用

2.11 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響Nrf2入核中的作用

與模型組Nrf2 蛋白入核率（10.41%±3.92%）比，miR-152-3p inhibitor組Nrf2 蛋白入核率（92.43%±7.19%）顯著升高（P＜0.01）；將miR-152.3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞并給予PIK3CA抑制劑干預(yù)后，與miR-152-3p inhibitor組比，miR-152-3p inhibitor+PIK3CA抑制劑組Nrf2 蛋白入核率（12.69%±5.58%）顯著降低（P＜0.01），見圖9。

圖9 PIK3CA抑制劑在miR-152-3p影響Nrf2入核中的作用（×400）

3 討論

ICH是腦卒中的主要亞型，占10%～15%，具有高病死率和致殘率[17]。全世界每年約有280萬人死于ICH，只有25%的ICH幸存者能夠在發(fā)病6個月后獨立生活[18]。既往研究大多聚焦于血腫的清除[19]，對于ICH誘導(dǎo)的繼發(fā)性腦損傷研究較少。鐵死亡是近年來發(fā)現(xiàn)的一種不同于細(xì)胞自噬、凋亡和焦亡的新型細(xì)胞死亡方式，表現(xiàn)出線粒體皺縮、脂質(zhì)過氧化增加，且鐵離子螯合劑可以抑制這一過程，而傳統(tǒng)的細(xì)胞凋亡、自噬和焦亡抑制劑均不能抑制其發(fā)生，說明該過程是鐵離子依賴的過程。鐵死亡的實質(zhì)是細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)氧化物代謝障礙，在鐵離子催化作用下代謝發(fā)生異常，當(dāng)細(xì)胞抗氧化能力減弱，脂質(zhì)活性氧堆積，使細(xì)胞內(nèi)氧化還原失衡，誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]。臨床及實驗研究均證實，ICH急性期及恢復(fù)期在病灶周圍腦組織持續(xù)存在的鐵沉積現(xiàn)象是由于ICH后伴隨血腫的融解及紅細(xì)胞的破壞，腦組織間隙大量血紅蛋白（hemoglobin, HGB）聚集，HGB進一步裂解為含鐵血紅素和珠蛋白，再通過血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1, HO-1）的作用進而釋放大量活性亞鐵離子。鐵作為血腫降解的主要活性產(chǎn)物，可通過多種途徑導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷[21]。本次研究使用oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞構(gòu)建ICH體外細(xì)胞模型，結(jié)果顯示，模型組細(xì)胞凋亡率顯著增高的同時，Nrf2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而在使用miR-152-3p inhibitor轉(zhuǎn)染入細(xì)胞后，oxyHb誘導(dǎo)大鼠神經(jīng)元細(xì)胞損傷得到顯著改善，并伴隨Nrf2蛋白表達(dá)升高，Nrf2蛋白入核量增多。

相關(guān)研究顯示激活Nrf2/ARE信號通路編碼大量抗氧化蛋白，通過抗鐵死亡作用減輕急性脊髓損 傷[22]。此外，膜鐵轉(zhuǎn)運蛋白是調(diào)控鐵向胞外轉(zhuǎn)運的主要蛋白，維持細(xì)胞內(nèi)鐵的穩(wěn)態(tài)，防止鐵過載誘發(fā)細(xì)胞的氧化損傷，其也受Nrf2 的調(diào)控。正常生理條件下，Nrf2 轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞質(zhì)中與接頭蛋白Keap1結(jié)合，不斷被泛素化蛋白酶體途徑降解，無法進入細(xì)胞核發(fā)揮轉(zhuǎn)錄活性[23]。當(dāng)受到氧化應(yīng)激時，Keap1分子構(gòu)象發(fā)生改變，抑制泛素連接酶活性，Nrf2與Keap1解離而被活化。活化的Nrf2進入細(xì)胞核與抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant reaction element, ARE）結(jié)合，啟動下游II相解毒酶、抗氧化蛋白等基因的表達(dá)[24]。此外，越來越多的證據(jù)表明，GSK-3β介導(dǎo)的非Keap1依賴的調(diào)節(jié)通路在Nrf2介導(dǎo)的鐵死亡中發(fā)揮重要作用。PI3K/AKT信號通路能夠負(fù)性調(diào)控GSK-3β活性，這歸因于GSK-3β可以被磷酸化的AKT激活而失去活性，而磷酸化的GSK-3β可以促進Nrf2的表達(dá)及核轉(zhuǎn)錄[25-27]。研究表明活化GSK-3β可有效保護阿茲海默癥導(dǎo)致的神經(jīng)元損傷[26]。 因此，AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路應(yīng)該是神經(jīng)元鐵死亡的重要機制之一。GPx4和SLC7A11蛋白表達(dá)降低是導(dǎo)致鐵死亡的主要因素[28-29]。本研究結(jié)果表明，與對照組神經(jīng)元細(xì)胞相比，模型組中神經(jīng)元細(xì)胞中GSK-3β/Nrf2信號通路蛋白表達(dá)水平顯著降低，證明GSK-3β/Nrf2 在神經(jīng)元損傷中具有保護作用，同時GPx4和SLC7A11蛋白表達(dá)水平顯著降低，表明模型組神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡增強，將miR-152-3p抑制表達(dá)后，可有效地活化AKT進而抑制GSK-3β的活化，使得Nrf2蛋白表達(dá)增加的同時，Nrf2蛋白入核量也得到增加，此機制可能是miR-152-3p inhibitor改善ICH導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡的作用機制。

TargetScan數(shù)據(jù)庫表明miR-152-3p可靶向性調(diào)控PIK3CA，PIK3CA活化能夠誘導(dǎo)PI3Ks的催化活性增強，PI3Ks能特異性磷酸化磷脂酰肌醇的3 位羥基，產(chǎn)生第二信使肌醇類物質(zhì)如PIP3，PIP3可促使AKT轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上并被PDK1/PDK2活化，從而激活PI3K/AKT信號通路[21-22]。因此，PIK3CA是AKT的上游因子之一[30-32]。在本研究中，使用PIK3CA抑制 后，miR-152-3p inhibitor改善ICH導(dǎo)致的鐵死亡作用受到抑制。

綜上所述，依據(jù)本研究結(jié)果，我們推斷miR-152-3p可能通過AKT/GSK-3β/Nrf2信號通路加劇ICH誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞鐵死亡，最終加劇ICH導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。