miR-769-3p在乳腺癌患者中的表達與臨床預后的關聯研究

劉汗青，李岱陽，吳子敬，周慧

沈陽醫學院基礎醫學院，沈陽 110034

乳腺癌是女性最常見的腫瘤，每年僅乳腺癌一項就占女性新診斷腫瘤的25%[1]。盡管過去的幾十年中乳腺癌的篩查、診斷和治療方面取得了進步，但一些患者的預后仍然很差[2]。因此，尋找更敏感、更有效的乳腺癌預后生物標志物迫在眉睫。多種分子信號被認為是乳腺癌預后的生物標志物，其中microRNAs具有潛在的臨床應用價值[3]。MicroRNAs（miRNAs）廣泛分布于動植物細胞中，是一類高度保守的內源性非編碼短序列RNA[4-5]。MicroRNAs 通過失活或誘導mRNA 降解，從而抑制翻譯，參與多種生物學過程，在腫瘤的發生和發展中起著至關重要的作用。miR-769-3p 于2006 年首次被發現[6]，定位于人19 號染色體，其成熟體由23 個堿基組成。據報道miR-769-3p與肝細胞癌和兒童膠質瘤相關[7]。然而，miR-769-3p在乳腺癌中的作用尚不清楚。本研究以癌癥基因組圖譜（TCGA）數據庫為基礎，探討miR-769-3p 在乳腺癌中的作用。

1 資料與方法

1.1 數據來源與預處理 從TCGA 數據庫乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma，BRCA）項目中下載miRNA-Seq 數據及其臨床信息[8]。

1.2 差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）分析 按照miR-769-3p 在乳腺癌樣本中的表達分成高表達組和低表達組，使用DESeq2 R3.8軟件包對HTSeq-Counts 數據分析差異表達基因[9]。|Log2Fold change|＞1.5 和adj.P ＜0.05 被認為是差異基因的閾值。

1.3 模型構建與評價 miR-769-3p 表達聯合臨床病理因素做單、多因素Cox 分析，篩選生存相關獨立預后因素。構建列線圖預測乳腺癌1 年、3 年和5 年的總生存率。R5.1-3 rms 用于繪制列線圖和校準曲線。所有統計檢驗均為雙尾檢驗，顯著性水平設為0.05。使用pROC 軟件包進行ROC 分析，評估miR-769-3p表達水平的敏感性和特異性。

1.4 統計學方法 BRCA 患者根據miR-769-3p 表達值分為兩組。Wilcoxon rank sum 檢驗用于比較癌癥組和正常組，Wilcoxon signed-rank 檢驗用于比較癌癥組和癌旁組。本研究通過Wilcoxon rank sum 檢驗或Kruskal-Wallis 檢驗和Logistic 回歸探討miR-769-3p表達與臨床病理特征的關系。Cox 回歸和KM 生存曲線用于揭示與BRCA 患者總生存率相關的臨床病理特征。Cox 多因素分析比較miR-769-3p 對生存率的影響以及其他臨床特征。所有假設檢驗均為雙側，P ＜0.05為顯著差異。所有統計分析均使用R 軟件進行。

2 結果

2.1 乳腺癌中 DEGs 的識別 從TCGA-BRCA 數據庫中提取1053 例患者的miRNA-Seq 數據及其臨床信息，其中配對癌旁樣本乳腺癌組織101 例。根據miR-769-3p表達的中位數，將乳腺癌樣本分為miR-769-3p 高表達組和miR-769-3p 低表達組。共鑒定出820 個DEGs基因，其中790 個基因上調30 個基因下調。

2.2 miR-769-3p 差異表達與乳腺癌和正常組織的關聯 結果顯示，miR-769-3p 在乳腺癌組織中的表達明顯高于正常組織，見圖1A。在配對樣本中，miR-769-3p 在乳腺癌BRCA 樣本中顯著高表達，結果具有統計學意義，見圖1B，提示miR-769-3p 可能促進乳腺癌的發生。接下來本研究通過ROC 曲線測量miR-769-3p 在腫瘤和非腫瘤樣本之間的區分能力，AUC 為0.682，代表對乳腺癌的中度區分能力，見圖1C。

圖1 miR-769-3p差異表達和乳腺癌與正常組織的關聯

2.3 miR-769-3p 表達與乳腺癌臨床病理特征相關 在1053 例標本中，miR-769-3p 低表達者527 例，miR-769-3p 高表達者526 例。相關分析顯示miR-769-3p 的表達與PR（negative/positive）、ER（negative/positive）、PAM50（Basal/Her2/LumA/LumB/Normal）、組織學類型（Infiltrating Ductal Carcinoma/Infiltrating Lobular Carcinoma）、種族（Asian Basal/Black or African American/ White）、TP53（Mut/WT）、PIK3CA（Mut/ WT）顯著相關。結果表明miR-769-3p 的高表達與乳腺癌臨床分類相關。

2.4 miR-769-3p 表達在乳腺癌患者中的臨床相關性分析 miR-769-3p 高表達與T 分期、種族、組織學類型、PR、ER、PAM50、TP53 和PIK3CA 之間存在顯著相關性，如圖2 所示。乳腺癌中miR-769-3p 高表達與PR、ER、組織學類型、TP53、PIK3CA 顯著相關，見表1。這些結果提示miR-769-3p 高表達與乳腺癌進展、預后不良相關。

表1 miR-769-3p表達的Logistic回歸分析

圖2 miR-769-3p表達在乳腺癌患者中的臨床相關性分析

2.5 miR-769-3p 表達與乳腺癌的總生存率相關 納入本研究的乳腺癌患者中，高表達miR-769-3p 和更短的OS 相關，見圖3A。miR-769-3p 高表達組在隨訪時間點為100、200 和300 個月的隨訪人數分別為38、2 和0 例。miR-769-3p 低表達組在隨訪時間點為100、200 和300 個月的隨訪人數分別為56、8 和0 例。使用Cox 回歸模型對OS 的預后因素進行單因素分析，miR-769-3p高表達與更短的OS相關。此外，TNM分期、病理階段、年齡、PR、ER、HER2、腫瘤狀態以及絕經期狀態也與不良OS 相關。使用Cox 回歸模型進行多因素分析發現，miR-769-3p 表達、年齡、腫瘤狀態和更年期狀態在多因素分析中與OS 獨立相關，見表2。上述結果表明miR-769-3p 在OS 中是獨立預后因子，因此，miR-769-3p 高表達預示更短的總生存期。

表2 miR-769-3p表達的單因素和多因素Cox回歸分析

圖3 miR-769-3p表達和乳腺癌預后分析模型構建

2.6 基于miR-769-3p 和臨床病理因素的乳腺癌預后分析模型構建 為給臨床醫師提供一種預測BRCA 患者預后的定量方法，構建了miR-769-3p 與獨立臨床危險因素（腫瘤狀態、年齡、絕經期狀態）相結合的列線圖，見圖3B、圖3C。在多因素Cox 分析的基礎上，采用量表對上述變量進行評分。校準曲線用于評價多因素Cox 模型的OS 風險預測效能，展示多因素Cox模型列線圖預測的風險概率與實際概率的一致性。與其他臨床特征相比，miR-769-3p 的表達是最危險的。列線圖的C 指數為0.874。這些結果表明miR-769-3p可以作為預測BRCA 患者生存率的獨立預后因子。

3 討論

以往研究表明miR-769-3p 可促進腫瘤肺轉移，抑制神經膠質瘤的進展，并與冠狀動脈疾病有關[10-12]。然而，miR-769-3p 在乳腺癌中的作用尚不清楚。因此，miR-769-3p 在乳腺癌中的潛在預后價值值得關注。

本研究使用TCGA 數據庫收集乳腺癌數據。與正常或鄰近組織相比，miR-769-3p 在乳腺癌組織中顯著上調。預后分析顯示miR-769-3p 的高表達表明更低的生存率。miR-769-3p 高表達的富集結果包括干細胞增殖、跨膜轉運復合體、細胞周期、DNA 復制和ABC 轉運蛋白。據報道，這些途徑促進了癌細胞增殖、侵襲和多藥耐藥，表明miR-769-3p 可作為乳腺癌新的預后靶點。本研究前期發現miR-769-3p 與Th2 細胞、肥大細胞和NK 細胞之間存在顯著的相關性。在miR-769-3p 高表達組，Th2、Treg 和Th1 細胞數較高，而肥大細胞、NK 細胞和NK-CD56 bright 細胞數較低。提示miR-769-3p 具有調節NK 細胞的潛在作用。NK細胞是先天免疫的重要成員，在腫瘤免疫中起著至關重要的作用。目前，旨在改善和恢復NK 細胞抗腫瘤活性的策略和方法正在多個方面得到實施。本研究推測miR-769-3p 的過度表達抑制NK 細胞免疫應答和免疫浸潤，miR-769-3p 在乳腺癌患者中的高表達可以觸發抗腫瘤免疫反應。綜上所述，miR-769-3p 在乳腺癌免疫細胞浸潤的調節和募集中起著重要作用。

本研究顯示miR-769-3p 在乳腺癌組織中表達上調，并與PAM50 和組織學類型相關，這突出了miR-769-3p 在乳腺癌發生發展中的潛在作用。本研究構建了乳腺癌患者的預后列線圖，miR-769-3p 高表達對生存預測的貢獻比其他特征高，換句話說，miR-769-3p 高表達的乳腺癌患者更容易出現預后差和生存期短的情況，因此，抑制miR-769-3p 可能會大大降低風險。這些結果表明，miR-769-3p 相關Cox比例風險回歸模型具有增強臨床預后檢驗的潛力。這有助于在未來的臨床試驗中改善患者分層和相應的治療計劃。另外，miR-769-3p 在乳腺癌組織中的高表達與TNM 分期、病理分期、年齡、預后差呈正相關。此外，miR-769-3p 高表達與乳腺癌T3、T4、N1 和M0 亞組的預后不良有關。當miR-769-3p 在乳腺癌中高表達時，不良OS 的HR 最高。總之，這些結果有力地證明miR-769-3p 是乳腺癌預后的生物標志物。

綜上所述，miR-769-3p 的高表達是乳腺癌生存不良的潛在預后標志物。但仍需進行全面、大規模的研究，以驗證此結論，增加miR-769-3p 在乳腺癌預后評估中的臨床應用。