重度窒息新生兒耳聾基因突變的檢出率分析*

甘進(jìn)錦 柯燕玲 馮海燕 李 超

廣東省茂名市人民醫(yī)院新生兒科 525000

新生兒窒息是因?yàn)樵诋a(chǎn)前、產(chǎn)中或是產(chǎn)后由多種病因,造成胎兒因氧氣不足而出現(xiàn)了宮內(nèi)窘迫或在分娩的過(guò)程中發(fā)生了呼吸功能障礙、循環(huán)障礙等,致使新生兒出生后1min內(nèi)沒(méi)有自主呼吸或無(wú)法建立規(guī)律呼吸,以高碳酸血癥、低氧血癥以及酸中毒等為其主要病理生理變化的疾病[1]。重度新生兒窒息會(huì)導(dǎo)致新生兒出現(xiàn)嚴(yán)重缺氧,進(jìn)而發(fā)生缺氧缺血性腦病。遺傳性耳聾癥是臨床中最為普遍的一種先天畸形,嚴(yán)重地危害著人們的身體健康,現(xiàn)已成為一個(gè)全球熱議問(wèn)題[2]。研究[3]表明,我國(guó)新生兒耳聾發(fā)生率高達(dá)3%左右,其中基因是導(dǎo)致耳聾的主要原因,高達(dá)60%以上。耳聾相關(guān)基因具有較強(qiáng)的遺傳與民族差異,其中GJB2、SLC26A4、12SrRNA以及GJB3是我國(guó)現(xiàn)階段最普遍的4個(gè)致病基因。基因突變位點(diǎn)的確定鑒定,為耳聾病因的精確診斷,新生兒遺傳篩查,育齡夫婦的婚育指導(dǎo)、防止藥源性耳聾等諸多方面具有重要意義[4]。基于此,本研究通過(guò)對(duì)我院30例重度窒息耳聾新生兒及30例耳聾新生兒進(jìn)行基因突變位點(diǎn)檢測(cè),并對(duì)其基因突變位點(diǎn)進(jìn)行分析,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月—2023年4月我院遺傳中心30例重度窒息耳聾新生兒(觀察組)以及30例耳聾新生兒(對(duì)照組)作為研究對(duì)象。兩組新生幼兒父母均知情本次研究,并簽署知情合同書(shū)。

1.2 耳聾基因篩查方法 耳聾基因篩查是通過(guò)血液提取DNA,采取基因芯片技術(shù)結(jié)合數(shù)據(jù)分析,對(duì)四個(gè)耳聾相關(guān)基因(GJB2、SLC26A4、GJB3和線粒體12SrRNA)的20個(gè)致聾突變位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.1 DNA提取方法。重度窒息耳聾新生兒采集其足跟血干血斑,耳聾新生兒采集其抗凝全血3mL,根據(jù)廣東凱普生物技術(shù)有限公司提供的血干血斑基因 DNA萃取試劑盒以及天根生物技術(shù)提供的血液基因組DNA提取試劑盒,嚴(yán)格按照使用說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品的純度及其濃度進(jìn)行測(cè)定,其中抗凝性的全血DNA含量≥1μg,干血斑點(diǎn)DNA含量≥200ng,并且A260/A280值為1.4～2.5,符合要求的樣品DNA暫時(shí)存放在-20℃環(huán)境下,以待處理。

1.2.2 PCR 擴(kuò)增。使用潮州凱普生物化學(xué)有限公司的導(dǎo)流雜交技術(shù)(Flow-through hybridization)以及耳聾易感基因檢測(cè)試劑盒(PCR+導(dǎo)流雜交法)對(duì)常見(jiàn)耳聾基因進(jìn)行檢測(cè),包括遺傳性耳聾的4個(gè)相關(guān)基因,共有20個(gè)熱點(diǎn)突變位點(diǎn):GJB2基因包含:299-300delAT、176-191del16、235delC、167delT、35delG突變;GJB3基因包含:538C>T及547G>A突變;SLC26A4基因包含:589G>A、281C>T、IVS7-2A>G、1975G>C、1226G>A、1174A>T、1229C>T、2162C>T、2027T>A、IVS15+5G>A以及2168A>G突變;12SrRNA基因包含:1494C>T及1555A>G突變。擴(kuò)增結(jié)束后,繼續(xù)進(jìn)行雜交和顯色。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者總突變率對(duì)比 觀察組中共檢出耳聾基因突變11例,總突變攜帶率為36.67%(11/30),對(duì)照組中共檢出耳聾基因突變2例,總突變攜帶率為6.67%(2/30)。

2.2 兩組單雜合突變檢測(cè)對(duì)比 觀察組單雜合單基因突變有11例,其中GJB2基因突變攜帶率為16.67%(5/30),SLC26A4基因突變攜帶率為13.33%(4/30),GJB3基因突變攜帶率為3.33%(1/30),12SrRNA基因突變攜帶率為3.33%(1/30);對(duì)照組單雜合單基因突變有2例,其中GJB2基因突變攜帶率為3.33%(1/30),SLC26A4基因突變攜帶率為3.33%(1/30),見(jiàn)表1。

表1 兩組耳聾基因單雜合突變檢測(cè)對(duì)比

2.3 兩組復(fù)合雜合突變檢測(cè)對(duì)比 觀察組復(fù)合雜合基因突變檢測(cè)結(jié)果顯示,有2例單基因復(fù)合雜合突變,2例雙基因復(fù)合雜合突變,對(duì)照組未發(fā)生復(fù)合雜合基因突變,見(jiàn)表2。

表2 觀察組耳聾基因復(fù)合雜合突變檢測(cè)對(duì)比

2.4 突變位點(diǎn)數(shù)檢測(cè) 觀察組在20個(gè)突變點(diǎn)位當(dāng)中,共檢出7個(gè)突變點(diǎn)位,其中GJB2基因的235delC點(diǎn)位檢出率最高,合計(jì)檢出3例,占總檢出率的27.27%(3/11);而GJB2基因的299-300delAT點(diǎn)位與SLC26A4基因的IVS7-2A>G點(diǎn)位均各檢測(cè)出2例,均占總檢出率的18.18%(2/11),見(jiàn)表1和表2。

3 討論

3.1 對(duì)重度窒息新生兒耳聾基因突變篩查的重要性及必要性 耳聾是造成新生兒質(zhì)量下降的主要原因之一[5]。我國(guó)對(duì)耳聾十分關(guān)注,隨著社會(huì)的不斷進(jìn)步,新生兒的聽(tīng)力檢查也逐漸發(fā)展起來(lái)。在我國(guó)廣東地區(qū)對(duì)新生嬰兒已實(shí)行免費(fèi)的聽(tīng)力檢查,且在篩查的同時(shí)發(fā)現(xiàn),并非所有的耳聾患兒都會(huì)在出生后很短時(shí)間內(nèi)表現(xiàn)出來(lái),延遲性耳聾和藥源性聾兒都可以順利通過(guò)新生兒聽(tīng)力篩選[6]。研究[7]顯示,60%左右的先天性耳聾患兒會(huì)伴有不同程度的遺傳。通過(guò)對(duì)新生兒進(jìn)行耳聾基因篩選,既能彌補(bǔ)聽(tīng)力檢查的缺陷,又能對(duì)帶有耳聾基因的先天性耳聾兒童做到盡早發(fā)現(xiàn)、盡早診斷以及盡早干預(yù),盡可能地減少因耳聾致啞的發(fā)生,同時(shí)也能發(fā)現(xiàn)藥物敏性的基因攜帶者。另外,對(duì)于具有耳聾基因且聽(tīng)力正常者,也可以為其在婚配、生育提供遺傳優(yōu)生方面的指導(dǎo),進(jìn)而避免遺傳性耳聾的發(fā)生。

3.2 重度窒息新生兒耳聾基因突變點(diǎn)位與篩查攜帶情況分析 本研究結(jié)果顯示,30例重度窒息新生兒中檢出耳聾基因突變11例,總的突變攜帶率為36.67%。本次研究耳聾基因突變的檢出率明顯高于其他研究報(bào)道[8-9],考慮其原因,可能與本研究的樣本量較少以及突變位點(diǎn)的選擇上有著一定的關(guān)系。與耳聾有關(guān)的基因較多,其突變位點(diǎn)區(qū)域和種族也存在一定的差異。在我國(guó),GJB2、SLC26A4以及12SrRNA是最主要的致病基因,這3種基因突變所導(dǎo)致的耳聾大約占遺傳性耳聾80%以上,GJB2、SLC26A4以及12SrRNA所導(dǎo)致的耳聾占比分別在55%、17%以及6.8%。因此,大多數(shù)的新生兒耳聾的遺傳學(xué)檢查都是以這3種最常用的遺傳學(xué)檢查為主。本研究根據(jù)流行病學(xué)資料,在篩選出GJB2、SLC26A4和12SrRNA等基因時(shí),增加了2個(gè)GJB3基因的突變位點(diǎn),從而增加了篩選位點(diǎn)數(shù)量。GJB3是首個(gè)由我國(guó)自主克隆并鑒定的耳聾致病基因,可導(dǎo)致常染色體顯性抑或者隱性遺傳性非綜合征性耳聾,在臨床中被認(rèn)為和高頻聽(tīng)力下降有著一定關(guān)系[10]。本文結(jié)果顯示,觀察組共檢出11例,總突變攜帶率為36.67%,其中為12SrRNA基因突變攜帶率為3.33%;GJB3基因突變攜帶率為3.33%。表示GJB3基因和12SrRNA基因在耳聾篩查上具有相同的重要作用。GJB3的攜帶有明顯的遺傳性或顯性遺傳病,其攜帶的GJB3需要對(duì)其進(jìn)行長(zhǎng)期的聽(tīng)力檢測(cè)。同時(shí),對(duì)發(fā)現(xiàn)12SrRNA基因突變的患者,也給予相應(yīng)的心理輔導(dǎo),告訴他們終身禁止使用氨基糖苷類(lèi)藥品,以免出現(xiàn)“一針致聾”的情況。此外,30例重度窒息新生兒共檢出GJB2基因突變5例(16.67%);SLC26A4基因突變4例(13.33%),這兩種基因突變的攜帶率與其他研究結(jié)果基本相吻合,同時(shí)也是4種基因突變攜帶率最高的,其中GJB2的235delC突變位點(diǎn),共檢出3例,占總突變的27.27%,而GJB2基因的299-300delAT點(diǎn)位與SLC26A4基因的IVS7-2A>G點(diǎn)位均各檢測(cè)出2例,均占總檢出率的18.18%。這3個(gè)位點(diǎn)在本次研究中檢出率最高,占總突變的23.33%,說(shuō)明這3個(gè)突變位點(diǎn)為重度窒息新生兒主要致聾位點(diǎn)。針對(duì)發(fā)現(xiàn)的235delC位點(diǎn)、299-300delAT位點(diǎn)以及IVS7-2A>G位點(diǎn)的基因突變患兒,均對(duì)其父母進(jìn)行一次遺傳咨詢(xún),并告訴他們?cè)谖磥?lái)再次生育時(shí),要做一次伴侶的耳聾基因檢測(cè),若伴侶是同型突變,那么孩子發(fā)生耳聾的概率是1/4。SLC26A4基因突變患兒可能會(huì)發(fā)展成后天中或重度的感音神經(jīng)性耳聾,因此需要密切跟蹤觀察。

3.3 研究局限性亟待解決問(wèn)題 本研究對(duì)20個(gè)耳聾突變位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè),但是這些突變位點(diǎn)并未全部涵蓋所有耳聾基因,因此仍有一些遺漏,僅能用于耳聾基因的篩選。對(duì)于篩選出來(lái)的聽(tīng)力正常耳聾患兒,還需要進(jìn)一步進(jìn)行遺傳學(xué)檢查,以確定其致病原因,以便重新妊娠時(shí)進(jìn)行產(chǎn)前的診斷,進(jìn)而防止家庭再次出現(xiàn)耳聾患兒。此外,由于本研究樣本數(shù)量過(guò)少,得到的結(jié)論具有一定的限制,差值比例相差較大,并不能代表所有臨床,還需要后期加大樣本量或通過(guò)多中心進(jìn)行研究。另外,現(xiàn)有的篩選方法無(wú)法改善患兒耳聾這一現(xiàn)狀,而傳統(tǒng)的藥物治療和中藥治療對(duì)耳聾也并不具備很好的療效。若能以此研究作為基礎(chǔ),對(duì)孕婦進(jìn)行耳聾基因變異篩查,并對(duì)攜帶耳聾基因夫婦實(shí)施產(chǎn)前檢查,可做好提前預(yù)防,避免幼兒發(fā)生遺傳性耳聾,為家庭及社會(huì)減輕負(fù)擔(dān)。

綜上所述,重度窒息新生兒耳聾基因突變攜帶率相對(duì)較高,對(duì)其實(shí)施耳聾基因篩查有助于早期防治。同時(shí)還會(huì)對(duì)孕婦進(jìn)行耳聾基因篩選,做好提前預(yù)防,避免出現(xiàn)遺傳性耳聾幼兒。