重度窒息新生兒耳聾基因突變的檢出率分析*

甘進錦 柯燕玲 馮海燕 李 超

廣東省茂名市人民醫院新生兒科 525000

新生兒窒息是因為在產前、產中或是產后由多種病因,造成胎兒因氧氣不足而出現了宮內窘迫或在分娩的過程中發生了呼吸功能障礙、循環障礙等,致使新生兒出生后1min內沒有自主呼吸或無法建立規律呼吸,以高碳酸血癥、低氧血癥以及酸中毒等為其主要病理生理變化的疾病[1]。重度新生兒窒息會導致新生兒出現嚴重缺氧,進而發生缺氧缺血性腦病。遺傳性耳聾癥是臨床中最為普遍的一種先天畸形,嚴重地危害著人們的身體健康,現已成為一個全球熱議問題[2]。研究[3]表明,我國新生兒耳聾發生率高達3%左右,其中基因是導致耳聾的主要原因,高達60%以上。耳聾相關基因具有較強的遺傳與民族差異,其中GJB2、SLC26A4、12SrRNA以及GJB3是我國現階段最普遍的4個致病基因。基因突變位點的確定鑒定,為耳聾病因的精確診斷,新生兒遺傳篩查,育齡夫婦的婚育指導、防止藥源性耳聾等諸多方面具有重要意義[4]。基于此,本研究通過對我院30例重度窒息耳聾新生兒及30例耳聾新生兒進行基因突變位點檢測,并對其基因突變位點進行分析,現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2021年1月—2023年4月我院遺傳中心30例重度窒息耳聾新生兒(觀察組)以及30例耳聾新生兒(對照組)作為研究對象。兩組新生幼兒父母均知情本次研究,并簽署知情合同書。

1.2 耳聾基因篩查方法 耳聾基因篩查是通過血液提取DNA,采取基因芯片技術結合數據分析,對四個耳聾相關基因(GJB2、SLC26A4、GJB3和線粒體12SrRNA)的20個致聾突變位點進行檢測。

1.2.1 DNA提取方法。重度窒息耳聾新生兒采集其足跟血干血斑,耳聾新生兒采集其抗凝全血3mL,根據廣東凱普生物技術有限公司提供的血干血斑基因 DNA萃取試劑盒以及天根生物技術提供的血液基因組DNA提取試劑盒,嚴格按照使用說明書對樣品的純度及其濃度進行測定,其中抗凝性的全血DNA含量≥1μg,干血斑點DNA含量≥200ng,并且A260/A280值為1.4～2.5,符合要求的樣品DNA暫時存放在-20℃環境下,以待處理。

1.2.2 PCR 擴增。使用潮州凱普生物化學有限公司的導流雜交技術(Flow-through hybridization)以及耳聾易感基因檢測試劑盒(PCR+導流雜交法)對常見耳聾基因進行檢測,包括遺傳性耳聾的4個相關基因,共有20個熱點突變位點:GJB2基因包含:299-300delAT、176-191del16、235delC、167delT、35delG突變;GJB3基因包含:538C>T及547G>A突變;SLC26A4基因包含:589G>A、281C>T、IVS7-2A>G、1975G>C、1226G>A、1174A>T、1229C>T、2162C>T、2027T>A、IVS15+5G>A以及2168A>G突變;12SrRNA基因包含:1494C>T及1555A>G突變。擴增結束后,繼續進行雜交和顯色。

2 結果

2.1 兩組患者總突變率對比 觀察組中共檢出耳聾基因突變11例,總突變攜帶率為36.67%(11/30),對照組中共檢出耳聾基因突變2例,總突變攜帶率為6.67%(2/30)。

2.2 兩組單雜合突變檢測對比 觀察組單雜合單基因突變有11例,其中GJB2基因突變攜帶率為16.67%(5/30),SLC26A4基因突變攜帶率為13.33%(4/30),GJB3基因突變攜帶率為3.33%(1/30),12SrRNA基因突變攜帶率為3.33%(1/30);對照組單雜合單基因突變有2例,其中GJB2基因突變攜帶率為3.33%(1/30),SLC26A4基因突變攜帶率為3.33%(1/30),見表1。

表1 兩組耳聾基因單雜合突變檢測對比

2.3 兩組復合雜合突變檢測對比 觀察組復合雜合基因突變檢測結果顯示,有2例單基因復合雜合突變,2例雙基因復合雜合突變,對照組未發生復合雜合基因突變,見表2。

表2 觀察組耳聾基因復合雜合突變檢測對比

2.4 突變位點數檢測 觀察組在20個突變點位當中,共檢出7個突變點位,其中GJB2基因的235delC點位檢出率最高,合計檢出3例,占總檢出率的27.27%(3/11);而GJB2基因的299-300delAT點位與SLC26A4基因的IVS7-2A>G點位均各檢測出2例,均占總檢出率的18.18%(2/11),見表1和表2。

3 討論

3.1 對重度窒息新生兒耳聾基因突變篩查的重要性及必要性 耳聾是造成新生兒質量下降的主要原因之一[5]。我國對耳聾十分關注,隨著社會的不斷進步,新生兒的聽力檢查也逐漸發展起來。在我國廣東地區對新生嬰兒已實行免費的聽力檢查,且在篩查的同時發現,并非所有的耳聾患兒都會在出生后很短時間內表現出來,延遲性耳聾和藥源性聾兒都可以順利通過新生兒聽力篩選[6]。研究[7]顯示,60%左右的先天性耳聾患兒會伴有不同程度的遺傳。通過對新生兒進行耳聾基因篩選,既能彌補聽力檢查的缺陷,又能對帶有耳聾基因的先天性耳聾兒童做到盡早發現、盡早診斷以及盡早干預,盡可能地減少因耳聾致啞的發生,同時也能發現藥物敏性的基因攜帶者。另外,對于具有耳聾基因且聽力正常者,也可以為其在婚配、生育提供遺傳優生方面的指導,進而避免遺傳性耳聾的發生。

3.2 重度窒息新生兒耳聾基因突變點位與篩查攜帶情況分析 本研究結果顯示,30例重度窒息新生兒中檢出耳聾基因突變11例,總的突變攜帶率為36.67%。本次研究耳聾基因突變的檢出率明顯高于其他研究報道[8-9],考慮其原因,可能與本研究的樣本量較少以及突變位點的選擇上有著一定的關系。與耳聾有關的基因較多,其突變位點區域和種族也存在一定的差異。在我國,GJB2、SLC26A4以及12SrRNA是最主要的致病基因,這3種基因突變所導致的耳聾大約占遺傳性耳聾80%以上,GJB2、SLC26A4以及12SrRNA所導致的耳聾占比分別在55%、17%以及6.8%。因此,大多數的新生兒耳聾的遺傳學檢查都是以這3種最常用的遺傳學檢查為主。本研究根據流行病學資料,在篩選出GJB2、SLC26A4和12SrRNA等基因時,增加了2個GJB3基因的突變位點,從而增加了篩選位點數量。GJB3是首個由我國自主克隆并鑒定的耳聾致病基因,可導致常染色體顯性抑或者隱性遺傳性非綜合征性耳聾,在臨床中被認為和高頻聽力下降有著一定關系[10]。本文結果顯示,觀察組共檢出11例,總突變攜帶率為36.67%,其中為12SrRNA基因突變攜帶率為3.33%;GJB3基因突變攜帶率為3.33%。表示GJB3基因和12SrRNA基因在耳聾篩查上具有相同的重要作用。GJB3的攜帶有明顯的遺傳性或顯性遺傳病,其攜帶的GJB3需要對其進行長期的聽力檢測。同時,對發現12SrRNA基因突變的患者,也給予相應的心理輔導,告訴他們終身禁止使用氨基糖苷類藥品,以免出現“一針致聾”的情況。此外,30例重度窒息新生兒共檢出GJB2基因突變5例(16.67%);SLC26A4基因突變4例(13.33%),這兩種基因突變的攜帶率與其他研究結果基本相吻合,同時也是4種基因突變攜帶率最高的,其中GJB2的235delC突變位點,共檢出3例,占總突變的27.27%,而GJB2基因的299-300delAT點位與SLC26A4基因的IVS7-2A>G點位均各檢測出2例,均占總檢出率的18.18%。這3個位點在本次研究中檢出率最高,占總突變的23.33%,說明這3個突變位點為重度窒息新生兒主要致聾位點。針對發現的235delC位點、299-300delAT位點以及IVS7-2A>G位點的基因突變患兒,均對其父母進行一次遺傳咨詢,并告訴他們在未來再次生育時,要做一次伴侶的耳聾基因檢測,若伴侶是同型突變,那么孩子發生耳聾的概率是1/4。SLC26A4基因突變患兒可能會發展成后天中或重度的感音神經性耳聾,因此需要密切跟蹤觀察。

3.3 研究局限性亟待解決問題 本研究對20個耳聾突變位點進行了檢測,但是這些突變位點并未全部涵蓋所有耳聾基因,因此仍有一些遺漏,僅能用于耳聾基因的篩選。對于篩選出來的聽力正常耳聾患兒,還需要進一步進行遺傳學檢查,以確定其致病原因,以便重新妊娠時進行產前的診斷,進而防止家庭再次出現耳聾患兒。此外,由于本研究樣本數量過少,得到的結論具有一定的限制,差值比例相差較大,并不能代表所有臨床,還需要后期加大樣本量或通過多中心進行研究。另外,現有的篩選方法無法改善患兒耳聾這一現狀,而傳統的藥物治療和中藥治療對耳聾也并不具備很好的療效。若能以此研究作為基礎,對孕婦進行耳聾基因變異篩查,并對攜帶耳聾基因夫婦實施產前檢查,可做好提前預防,避免幼兒發生遺傳性耳聾,為家庭及社會減輕負擔。

綜上所述,重度窒息新生兒耳聾基因突變攜帶率相對較高,對其實施耳聾基因篩查有助于早期防治。同時還會對孕婦進行耳聾基因篩選,做好提前預防,避免出現遺傳性耳聾幼兒。