基于生物信息學鑒定頭頸鱗癌預后關鍵基因

溫凌杜 張夏睿

1 溫德口腔醫院,廣東省深圳市 518000; 2 寶安中醫院口腔科

頭頸癌是第七大常見癌癥,其中約90%為鱗狀細胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)。僅2020一年中全球頭頸癌新發病例就高達93萬余例,且由于復發和轉移的高發生率導致患者的總體生存率依然較低[1]。可見居高不下的發病率及未見明顯改善的生存率成為目前研究亟須解決的問題,同時也凸顯了發現穩定的預后生物標志物或治療靶點以改善HNSCC臨床診療的迫切需求。

本研究使用生物信息學方法篩選GEO中HNSCC和癌旁樣本間的差異表達基因(Differentially expressed genes,DEGs),富集分析和建立的蛋白質—蛋白質相互作用(Protein-protein interaction,PPI)網絡初步揭示了HNSCC中分子間的調控機制。進一步挖掘PPI網絡中預后相關的關鍵基因,除通過GEPIA、TCGA再次驗證外,也對既往研究尚未明確的與HNSCC預后相關的關鍵基因行臨床病理特征分析,期望可為HNSCC的診療提供新的生物標志物。

1 材料與方法

1.1 GEO中HNSCC DEGs的篩選 在GEO中以“HNSCC,series,expression profiling by array,homo sapiens”為檢索條件獲得GSE6631、GSE58911和GSE107591 微陣列數據集。GEO2R以|logFC|>1(Fold change, FC)和FDR<0.05(False discovery rate, FDR)作為具有統計學意義的閾值(以下簡稱閾值)逐一篩選出3個數據集中HNSCC和癌旁樣本間的DEGs。進一步鑒定出三者間交叉的DEGs待后續分析。

1.2 DAVID中DEGs的富集分析 在DAVID中以FDR<0.05為閾值分別行DEGs的分子功能(Molecular function,MF)、細胞成分(Cellular component,CC)、生物過程(Biological process,BP)和通路的生物學富集分析。

1.3 STRING中DEGs PPI網絡的構建和關鍵基因的篩選 在STRING中以interaction score≥0.4為閾值構建DEGs的PPI網絡,Cytoscape(v3.8.0)行可視化處理。Cytoscape MCODE(v1.6.1)插件以“degree cutoff=2,max.depth=100,k-core=2,node score cutoff=0.2”為條件對DEGs的PPI網絡進行聚類,篩選出中央節點作為關鍵基因待后續分析。

1.4 GEPIA中關鍵基因的初次驗證和預后分析 在GEPIA中以“HNSCC,gene name”為條件對關鍵基因在HNSCC和癌旁樣本中的差異表達行初次驗證。Kaplan-Meier生存分析明確HNSCC中關鍵基因的表達與患者總生存期(Overall survival,OS)的相關性。篩選出HNSCC中預后相關的關鍵基因待后續分析。

1.5 TCGA中PLAU的再次驗證和臨床病例特征的相關性分析 TCGA中檢索并整理HNSCC和癌旁樣本的PLAU表達數據以及HNSCC患者的臨床病理數據。R(v3.6.0)limma包行差異表達分析再次驗證PLAU的表達,R wilcox.test和kruskal.test函數對HNSCC樣本中PLAU的表達與患者的臨床病理特征行相關性分析。

1.6 統計學方法 應用R語言完成統計分析,除文中特殊說明的閾值外,其余均以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 GEO中 HNSCC DEGs的篩選 從GSE6631、GSE58911和 GSE107591中共納入61例HNSCC和60例癌旁樣本,GEO2R分別篩選出168、599和484個DEGs(|logFC|>1和FDR<0.05),鑒定出71個三者交叉的DEGs待后續分析,其中29個上調(MMP1、TNC、SPP1、SERPINH1、SERPINE1、SEMA3C、RBP1、PTHLH、POSTN、PLAU、MMP9、MMP3、MMP13、MMP12、MMP10、LUM、LAMC2、LAMB3、IGF2BP3、FN1、FAP、DFNA5、CXCL8、COL6A3、COL5A2、COL4A2、COL4A1、COL3A1、COL1A1)和42個下調(TGM3、SPINK5、SLURP1、SERPINB1、SCNN1A、SCEL、SASH1、RRAGD、PTN、PPP1R3C、PPL、PGD、NUCB2、MGLL、MAL、LPIN1、KRT4、KRT13、HPGD、HOPX、GPD1L、EXPH5、ENDOU、EMP1、ECM1、DPT、CRYAB、CRISP3、CFD、CEACAM6、CEACAM5、CEACAM1、CD24、BLNK、BARX2、AQP3、APOD、ALOX12、ALDH3A1、ADH7、ACPP、ABLIM1)。

2.2 DAVID中DEGs的富集分析 在DAVID中對71個DEGs行富集分析。結果顯示(FDR<0.05),BP中DEGs多富集在細胞外基質組織、細胞黏附和膠原蛋白分解過程等;CC中DEGs多富集在細胞外間隙、細胞外泌體和胞外區等;MF中DEGs多富集在絲氨酸型內肽酶活性、金屬內肽酶活性和細胞外基質結構成分等;通路中DEGs多富集在ECM-受體相互作用、PI3K-Akt和癌癥等通路。

2.3 STRING中DEGs PPI網絡的構建和關鍵基因的篩選 將71個DEGs導入STRING中,去除無相互作用的DEGs后構建的PPI網絡(見圖1)包括56個節點和193個連線(interaction score≥0.4)。

圖1 DEGs PPI網絡的構建與關鍵基因的篩選

Cytoscape MCODE插件篩選出15個中央節點DEGs(SERPINH1、SERPINE1、SPP1、MMP1、PLAU、MMP13、LUM、MMP3、MMP9、CXCL8、COL4A1、COL4A2、MMP10、COL5A2、COL6A3)作為關鍵基因待后續分析(見圖2)。

圖2 關鍵基因的篩選

2.4 GEPIA中關鍵基因的初次驗證和預后分析 通過GEPIA在519個HNSCC和44個癌旁樣本間驗證15個關鍵基因的表達。結果顯示(圖3展示了其中5個),與癌旁樣本相比15個關鍵基因在HNSCC中均表達上調(P<0.05),驗證了GEO中數據分析的結果。15個關鍵基因的Kaplan-Meier生存分析結果顯示(見圖4),在HNSCC中僅有5個(SERPINH1、SERPINE1、SPP1、MMP1、PLAU)關鍵基因的表達與OS相關(P<0.05)。

圖3 GEPIA中關鍵基因的差異表達分析

圖4 GEPIA中5個關鍵基因的生存分析

2.5 TCGA中PLAU的再次驗證和臨床病例特征的相關性分析 通過TCGA中330個HNSCC和32個癌旁樣本驗證PLAU的表達。結果無論組間分析或成對分析PLAU均在HNSCC中表達上調(P<0.05,見圖5a～b),與GEPIA和GEO的數據分析結果一致。進一步與臨床病理特征的相關性分析顯示(見圖5c～d),HNSCC患者中PLAU的表達水平與患者的組織分化程度和頸部淋巴結轉移相關(P<0.05)。

圖5 TCGA中PLAU的表達及與臨床病理相關性分析

3 討論

本研究基于生物信息學分析GEO、DAVID、STRING、GEPIA和TCGA數據庫,多次對數據分析結果驗證后鑒定出5個表達上調的DEGs(SERPINH1、SERPINE1、SPP1、MMP1、PLAU)可作為HNSCC患者預后相關的關鍵基因。

SERPINH1可調節細胞外基質蛋白和纖維連接蛋白的表達,其發生功能障礙后可刺激細胞外基質蛋白的異常表達從而促進上皮間充質轉化[2]。Wang等[3]通過泛癌數據分析同樣發現SERPINH1的異常高表達顯著降低了包括HNSCC在內的11種癌癥的總生存期、疾病特異性生存期和無進展間期。另有實驗研究也支持了本研究的結果,發現SERPINH1的表達在OSCC中顯著上調,沉默其表達可抑制OSCC細胞的增殖和轉移,同時還受到miR-29c的調節[4]。SERPINE1在癌癥進展中參與增殖信號維持、血管生成和抵抗腫瘤死亡等重要過程[5]。Minemur等[6]研究表明,在HNSCC的全基因組表達譜中SERPINE1表達上調是HNSCC中的常見事件,其異常高表達可增強HNSCC細胞的遷移和侵襲以及向淋巴結和肺的轉移播散,因此導致高表達的HNSCC患者生存期較短。此研究與本文的研究結果均表明了SERPINE1具有成為對HNSCC患者進行預后風險分層的新型預測分子的可能性。SPP1被發現在多種癌癥中異常高表達,如SPP1可通過介導Smad4/PTEN通路參與前列腺癌的復發和轉移[7],以及抑制SPP1表達可激活ERK1/2通路來抑制食管鱗癌細胞的增殖和遷移[8]。在HNSCC中Liu等[9]研究發現SPP1的異常高表達與患者的生存期呈負相關,這與本研究結果一致。進一步的機制研究發現其過表達同樣也影響HNSCC細胞的增殖、遷移、侵襲和存活并抑制凋亡,此外KRAS/MEK通路的激活有助于SPP1誘導的HNSCC惡性進展和對西妥昔單抗的耐藥性,可見其在預后預測和治療靶點中擁有重要價值。

MMP1通過降解細胞外基質的成分來促進惡性腫瘤的侵襲和轉移[10]。Liu等[11]已研究表明MMP1可增強HNSCC細胞的轉移能力,其表達上調與預后不良相關。PLAU和MMP1在惡性腫瘤中發揮相似的作用,兩者與OSCC中的細胞外基質、細胞間黏附和膠原分解代謝有關,表現出高度的關聯性[12]。但在查閱國內既往文獻中發現僅少數學者同樣經數據分析發現PLAU在HNSCC中的差異表達[13],但未對PLAU的臨床意義進行分析。本研究結果表明,HNSCC中PLAU呈高表達,使GEO、GEPIA和TCGA分析的結果得到驗證,并且還與患者的組織分化程度和頸部淋巴結轉移相關。

綜上所述,本研究通過對多個數據庫行生物信息學分析鑒定出HNSCC中SERPINH1、SERPINE1、SPP1、MMP1和PLAU這5個表達上調且預后相關的DEGs。此分析提供了一個新的角度來鑒定HNSCC中的潛在標志物,但還需深入研究來闡明其中的分子調控機制,而本文數據可為HNSCC的潛在預后生物標志物和治療靶點的研究提供新的思路。