龍血素B通過P38MAPK信號通路調控MC3T3-E1成骨分化和骨形成的機制*

李經堂 涂樂佳 陳 淼 魏 鵬 周璟瑜

江西省人民醫院(南昌醫學院第一附屬醫院) 1 創傷急救科 2 血管外科,江西省南昌市 330006 ; 3 南昌大學醫學院骨科

骨缺損是指骨組織中連續的骨結構喪失,骨組織完整性被破壞進而影響骨骼強度和功能[1]。外科手術是目前治療骨缺損的常用手段,主要是將自體或異體骨組織移植到骨缺損部位并應用人工材料輔助支撐及修復,但自體骨來源有限,異體骨移植可能會出現排異反應等并發癥導致植骨失敗,同時手術有局部感染和術后愈合不良的風險,在臨床應用上有一定局限性[2-3]。祖國醫學博大精深,中醫藥治療骨科疾病經驗豐富,傳統中藥用于骨傷治療的歷史悠久,療效確切[4]。龍血竭是來源于百合科植物劍葉龍血樹樹脂的傳統中藥,具有活血化瘀、通絡止痛的功效,對于扭傷、骨折、骨質疏松等骨傷病癥均有較好療效[5-6]。龍血素B是其主要活性成分之一,研究表明,龍血素B可通過P38MAPK信號通路抑制破骨細胞增殖[7]。骨缺損的修復與破骨細胞和成骨細胞相互協調作用密切相關,而龍血素B對于成骨細胞的作用暫未見有文獻報道。基于此,本研究培養小鼠胚胎成骨細胞前體細胞(MC3T3-E1細胞),加入龍血素B單體共培養進行干預實驗,觀察龍血素B對MC3T3-E1細胞增殖分化、成骨能力的影響,并以P38MAPK信號通路為切入點探究其作用機制,現報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞來源和實驗試劑 MC3T3-E1細胞由中國科學院上海生命科學研究院提供。DMEM培養基和胎牛血清購自美國Hyclone公司,龍血素B、SB203580、茜紅素購自武漢三鷹生物技術有限公司,堿性磷酸酶(ALP)活性檢測試劑盒、反轉錄試劑盒、CCK8試劑盒、細胞凋亡試劑盒購自上海翌圣生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養和龍血素B干預。MC3T3-E1細胞于-80℃冰箱中保存,取出凍存管置于37℃水浴鍋中快速解凍,酒精消毒后移入生物安全柜,配置含10%FCS的DMEM培養液,使用培養液重懸細胞,接種于培養皿中,置于37℃,5%CO2細胞培養箱中培養。培養3～6代后,選取對數生長期的MC3T3-E1細胞,0.25%胰蛋白酶消化,制備細胞懸液,調整密度為1.0×105個/mL,接種于96孔板,每孔100μL,置于培養箱繼續培養過夜;棄去原培養液,分別加入含龍血素B濃度為0、15、30、60、90、120μmol/L的完全培養基溶液各90μL,陰性對照組加入完全培養基90μL,于培養箱中繼續培養。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞增殖活性。龍血素B干預24h、48h、72h后,棄去含藥培養液,每孔加入CCK-8溶液10μL,振蕩混勻,于細胞培養箱中孵育2h;酶標儀檢測450nm波長處吸光度(OD值),以此反映細胞增殖活性,增殖率=(OD加藥組-OD對照組)/OD對照組×100%。

1.2.3 流式細胞術(FCM)檢測細胞凋亡水平。取MC3T3-E1細胞,制備密度為1.0×105個/mL的細胞懸液,接種于6孔板,每孔2mL。按上述步驟采用不同濃度及作用時間龍血素B干預,消化收取細胞,離心后PBS洗2次,加入Binding Buffer重懸,按照細胞凋亡試劑盒方案染色,使用流式細胞儀檢測細胞凋亡水平。

1.2.4 細胞分組。根據不同濃度及作用時間給藥干預后細胞增殖和凋亡檢測結果,以MC3T3-E1細胞增殖率達到峰值的龍血素B濃度和作用時間為基礎進行后續實驗。將MC3T3-E1細胞接種于6孔板,按不同干預方式分為3組,空白組:常規培養,不做任何干預;龍血素B組:以最佳濃度及作用時間龍血素B干預;龍血素B+阻斷劑組:以龍血素B+10μmol/L P38抑制劑SB203580干預。干預結束后繼續棄去含藥培養液,更換為成骨誘導培養基(含1%甘油磷酸鈉、0.2%抗壞血酸、0.01%地塞米松)繼續培養,每3d換液。

1.2.5 各組細胞ALP活性測定。分別于干預結束后第1、3、5天測定各組細胞ALP活性。棄去培養液,PBS洗2次,加入細胞裂解液使細胞充分裂解,按試劑盒說明配制對硝基苯磷酸(PNPP)顯色底物溶液,樣品與底物在pH 10.3的反應緩沖液內,37℃下反應30min,加入反應終止液終止反應。酶標儀檢測405nm波長處吸光度(OD值),ALP活性與OD405值成正比。

1.2.6 qRT-PCR法檢測各組細胞OPN、OCN、BSP基因表達水平。干預結束后,收取各組細胞,采用TRIzol法提取總RNA,依照反轉錄試劑盒說明獲取cDNA,以cDNA為模板,進行PCR擴增。內參為GAPDH,OPN、OCN、BSP的mRNA相對表達水平采用2-ΔΔCt計算。

1.2.7 茜素紅染色法觀察各組細胞骨形成能力。干預結束后第21天對各組細胞進行茜素紅染色,觀察鈣化結節形成情況。棄去培養液,PBS洗滌細胞,加入95%酒精固定10min,PBS洗滌后使用0.1%茜素紅染色,避光孵育30min,去離子水洗去浮色,置于顯微鏡下觀察拍照,Image J軟件分析鈣化結節面積百分比。

2 結果

2.1 龍血素B對MC3T3-E1細胞增殖的影響 同一時間點,MC3T3-E1細胞增殖率與龍血素B濃度正相關,藥物濃度為90μmol/L時,細胞增殖率相比于藥物濃度較低時明顯升高(P<0.05),且與藥物濃度為120μmol/L時無統計學差異(P>0.05);相同濃度下,龍血素B干預48h時MC3T3-E1細胞增殖率明顯高于24h和72h(P<0.05)。見圖1。

圖1 龍血素B對MC3T3-E1細胞增殖的影響

2.2 龍血素B對MC3T3-E1細胞凋亡的影響 同一時間點,MC3T3-E1細胞凋亡率與龍血素B濃度負相關,藥物濃度為90μmol/L時,細胞凋亡率相比于藥物濃度較低時明顯降低(P<0.05),且與藥物濃度為120μmol/L時無統計學差異(P>0.05);相同濃度下,龍血素B干預48h時MC3T3-E1細胞凋亡率明顯低于24h和72h(P<0.05),見表1。基于2.1和2.2結果,選擇龍血素B濃度90μmol/L,作用時間48h作為后續實驗干預條件。

2.3 各組MC3T3-E1細胞ALP活性比較 在干預后第1、3、5天時,龍血素B組MC3T3-E1細胞ALP活性均高于空白組和龍血素B+阻斷劑組(P<0.05)。見圖2。

圖2 各組MC3T3-E1細胞ALP活性比較

2.4 各組MC3T3-E1細胞OPN、OCN、BSP基因表達水平比較 龍血素B組MC3T3-E1細胞OPN、OCN、BSP的mRNA相對表達量均高于空白組和龍血素B+阻斷劑組(P<0.05)。見圖3。

圖3 各組MC3T3-E1細胞OPN、OCN、BSP基因表達水平比較

2.5 各組MC3T3-E1細胞骨形成能力比較 龍血素B組MC3T3-E1細胞鈣化結節區域面積較空白組顯著增大,而龍血素B+阻斷劑組細胞鈣化結節區域面積較龍血素B組顯著減小(P<0.05)。見圖4。

圖4 各組MC3T3-E1細胞骨形成能力比較

3 討論

骨缺損一般由感染、創傷、腫瘤、骨質代謝異常等因素引起,其癥狀與缺損部位和嚴重程度有關,表現為疼痛、肢體畸形、關節活動障礙等,嚴重影響患者生活質量[8-9]。近年來,運用現代科學方法提取分離中藥活性成分并進行研究分析已成為熱門方向,單一活性成分即中藥單體的作用及機制研究對提升傳統中藥療效,減少副作用具有重要意義,已有多種中藥單體被證明對骨缺損的修復有促進作用[10-11]。龍血素B是“活血圣藥”龍血竭中黃酮類的主要活性成分,相關研究顯示其具有消炎、鎮痛、抗氧化多種生物活性,對于神經細胞、肝星狀細胞、破骨細胞等多種細胞的增殖分化和功能發揮均有調控作用[12-13]。成骨細胞是人體骨組織的重要組成成分,也是參與骨形成的主要功能細胞,在骨骼生長發育及骨量維持方面扮演著關鍵角色。它來源于具有多向分化潛能的骨髓間充質干細胞,經細胞增殖、細胞外基質合成、成熟及礦化后最終發展成為骨細胞,參與骨形成及骨修復[14]。本研究體外培養成骨前體細胞株MC3T3-E1細胞,并分析其與龍血素B共培養時的增殖和凋亡情況,結果顯示,龍血素B可促進MC3T3-E1細胞增殖并抑制其凋亡,且效果呈現一定的濃度依賴性,其促MC3T3-E1細胞生長的最佳濃度和作用時間為90μmol/L、干預48h。而成骨細胞數量增加是骨基質合成和骨組織生長的基礎,提示龍血素B對骨的形成具有促進作用。

MC3T3-E1細胞為成骨前體細胞,可分化為成熟成骨細胞,進而合成分泌骨基質,并促進鈣化和新骨形成,研究表明,P38MAPK信號通路對其成骨分化有重要影響[15]。為進一步探究龍血素B對MC3T3-E1細胞成骨分化和骨形成的影響,本研究使用龍血素B對MC3T3-E1細胞進行干預,并加入抑制劑SB203580阻斷P38MAPK信號通路,從細胞水平探討其刺激骨分化和骨形成的作用機制。ALP可促進羥基磷灰石的沉積,是骨形成早期標志物;OPN、OCN、BSP是成骨特定基因,其表達和相應蛋白的合成可促進羥磷灰石礦化的成核作用,并增加鈣結節形成,可反映MC3T3-E1細胞成骨分化程度[16]。本研究結果顯示,龍血素B干預后,MC3T3-E1細胞ALP活性和成骨相關基因表達水平均顯著升高,而阻斷P38MAPK信號通路后,MC3T3-E1細胞ALP活性和成骨相關基因表達水平顯著下降,提示龍血素B可有效促進MC3T3-E1細胞的成骨分化,且這一作用與P38MAPK信號通路相關。成骨分化中晚期以鈣離子沉積為主,鈣結節形成越多,表明新骨形成能力越強[17]。本研究結果顯示,龍血素B干預下,成骨誘導后MC3T3-E1細胞鈣化結節區域面積顯著增大,而加入P38MAPK阻斷劑后MC3T3-E1細胞鈣化結節區域面積顯著減小,表明龍血素B可通過P38MAPK信號通路在新骨形成過程中發揮促進作用。

綜上所述,龍血素B可通過調控P38MAPK信號通路,促進MC3T3-E1細胞增殖,刺激成骨分化和骨形成。為臨床上骨缺損的治療提供新的思路和理論依據,值得進一步研究。