釀酒酵母的改造及其在動物生產中的應用進展

劉 真 夏 冰 董彥君 劉 明*

(1.北京農學院動物科學技術學院,北京 102206;2.北京中農弘科生物技術有限公司,北京 100226)

人類利用釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)進行發酵、釀造和烘焙的歷史非常悠久[1]。釀酒酵母是一種“通常被認為是安全的”食品級出芽酵母,在發酵食品(面包和饅頭)、飲料(如啤酒、葡萄酒、白酒等)、生物燃料和生物制藥方面已有廣泛的應用[2-3]。還具備在動物生產上應用的潛力。釀酒酵母具有蛋白質含量高、細胞體積大等特點,被廣泛用于單胃和反芻動物的飼料中,是酵母菌中應用范圍最廣的一類[4]。

然而,盡管釀酒酵母在動物生產上的應用前景令人振奮,但也面臨著一些挑戰和不穩定因素。為了提高釀酒酵母的生長繁殖與代謝能力,生產更多單細胞蛋白、酶類等功能性物質,在釀酒酵母改造方面做出了諸多重要突破。近年來,隨著基因編輯技術和合成生物學的飛速發展,在釀酒酵母的應用越來越深入,能夠快速高效地改造釀酒酵母,提高釀酒酵母各方面的性能,如生長速度、代謝活力、活性氧耐受性等。

1 釀酒酵母的基本特征

釀酒酵母一般呈圓形、卵形或橢圓形,其寬度為2.5～10.0 μm,長度為4.5～21.0 μm。細胞無真菌絲并通過重復出芽繁殖,有些細胞發育為含1～4個孢子的子囊。與細菌細胞相比,釀酒酵母細胞較大,生長周期短、發酵能力強。釀酒酵母是兼性厭氧微生物,盡管它可以在微氧條件下生存,但氧氣是維持酵母細胞活性的重要因素,在供氧不足的條件下,增殖減速,其代謝產物也會發生改變[4]。釀酒酵母生長的最適pH為4.5～7.0,但大多數情況下在pH為3.0的環境下仍能生長[4],最適生長溫度為28～30 ℃,其次,釀酒酵母具有耐酸性強[5]、生長迅速、代謝繁殖快、易培養等優點,并且其基因組信息已知、遺傳操作簡便、具有真核生物對蛋白質翻譯后加工和修飾的特性,早在1996年,釀酒酵母的全基因測序已全部完成,是第1個基因組測序完成的真核生物,釀酒酵母基因組總共大約編碼6 100個基因,目前,已通過基因敲除技術完成96%己知基因的功能解析,也是第1個可用于外源基因表達的真核生物[6]。

2 釀酒酵母改造的技術手段

隨著釀酒酵母在飼料產業中的廣泛應用,改造釀酒酵母已成為微生物領域熱點研究課題之一[7]。基因工程技術可在分子水平上實現對基因的操作,將外源基因引入釀酒酵母,使這個基因能夠在釀酒酵母細胞內復制、轉錄和翻譯表達。張雅琦[8]通過基因工程技術構建了木糖異構途徑的釀酒酵母,結合定向進化策略,最終在第30代進化菌中獲得可利用木糖產乙醇的工程菌突變體,乙醇產量可達2.39 g/L。

在動物生產中應用的釀酒酵母改造中,涉及多種技術手段:如基因編輯技術、基因組合成和基因表達調控、代謝工程和蛋白質工程等,以及這些技術的組合使用,都可以改善釀酒酵母的生產性能。近年來,尤其是基因編輯技術和合成生物學的改造技術倍受重視。

2.1 基因編輯技術

基因編輯技術是對目標基因組位點利用酶(特別是核酸酶)進行特異性修飾,包括基因敲除、敲入、替換和有益的點突變[9]。釀酒酵母同源片段重組效率高,靶基因的敲入或敲除只需要合適的篩選標記和供體片段上下游40～60 bp的同源序列[10],因此,早期主要基于同源重組和篩選標記的基因編輯技術[11],但這種改造方法效率較低[12]。目前主要利用4種基因編輯技術對釀酒酵母進行改造:歸巢核酸內切酶(MegNs)系統、1996年興起的鋅指核酸酶(ZFNs)系統、2009年出現的轉錄激活因子樣效應物核酸酶(TALENs)系統和2013年之后飛速發展的成簇規律間隔短回文重復序列(CRISPR)相關的表達系統,這些技術的相繼出現推進了基因功能的研究進程。由于CRISPR技術的迅猛發展,以及該基因編輯技術效率高、成本更低且可以同時定點改造釀酒酵母的多個基因[7],成為替代ZFNs和TALENs技術的一種有效的方案[13]。

CRISPR/Cas系統由CRISPR陣列和Cas基因組成,是在細菌和古菌中發現的自適應防疫系統,可以保護宿主免受病毒外源侵襲,CRISPR/Cas系統的作用機理已經被研究的較為清晰,該系統抵御外來DNA入侵的過程主要分為3步:入侵適應階段、表達階段和干擾階段[14]。根據Makarova等[15]的分類方法,可以把CRISPR/Cas系統分為2類、6種類型、17個亞型,該研究使用的CRISPR/Cas9系統屬于第2類Ⅱ型,該系統可以通過特定的sgRNA特異性識別對應的DNA序列,介導Cas9蛋白進行切割,DNA雙鏈被切開之后,Cas9可以引入特定的序列插入切割位點,對雙鏈進行修復,從而進行基因突變、敲除和整合。2013年,Dicarlo等[16]研究團隊運用CRISPR/Cas系統首次在釀酒酵母成功實現了高效的基因組編輯,實現了CAN1和ADE2基因的敲除,其編輯效率接近100%。由于CRISPR/Cas9系統比較簡單,能便捷高效的對基因組進行定點編輯,因此該基因編輯技術在釀酒酵母中應用較為廣泛[17-19]。例如,Ronda等[20]利用CRISPR/Cas系統在釀酒酵母中一次整合了3個長度為5.1～6.6 kb的胡蘿卜素合成途徑基因,3個基因同時整合的效率高達85%。Shi等[21]在釀酒酵母基因組整合多達18個拷貝的木糖利用和2,3-丁二醇(BDO)合成途徑,實現木糖到BDO的高效轉化等。

2.2 基于合成生物學的改造技術

除基因編輯技術外,合成生物學在釀酒酵母的改造中應用也很廣泛。合成生物學是交叉學科,融合了生物化學、生物醫學和細胞生物學等多門學科,應用領域廣泛,為釀酒酵母改造拓展了新的思路[22]。合成生物學包括代謝工程和基因工程。合成生物學提供了設計和優化新代謝通路的框架,通過模塊化的方法,將生物體系分解為功能模塊,然后重新組合這些模塊以構建新的代謝路徑[23]。此外,合成生物學還涉及到設計合適的調控元件,如啟動子和終止子,采用人工構建和合成啟動子的方法來調節基因表達,研究人員可以根據目標產物需求來選擇相應的啟動子[24-25],以確保每個模塊在適當的時間和水平表達。

代謝工程是通過優化細胞遺傳和調控過程改造酵母細胞的代謝通路,調整其產生目標代謝產物的能力,促進有益的代謝產物(抗生素或酶)的生產,或減少不利代謝產物的生成,還致力于加強細胞多底物利用的能力、改善菌株發酵性能和增強菌株的魯棒性(如惡劣條件下的耐受性)[26]。Xu等[27]用膽固醇22-羥化酶構建薯蕷皂素(DSG)生物合成途徑,篩選出了與DSG合成相關的細胞色素P450(CYP)與細胞色素P450還原酶(CPR)的最佳比例,提高DSG產量,同時削弱ERG6基因的表達,進一步增加DSG的合成并減少副產品形成。釀酒酵母常用的2種基因改造方式如圖1。

glucose:葡萄糖;UDP-glucose:二磷酸尿苷-葡萄糖 uridine diphosphate-glucose;glc3和alg5:二磷酸尿苷-葡萄糖合成的關鍵基因 uridine diphosphate-a key gene for glucose synthesis;eng1:內切β-葡聚糖酶基因 endo-β-glucanase gene;β-glucan:β-葡聚糖;learn:學習;design:設計;rebuild:重建;Pathway 1:途徑1;Pathway 2:途徑2;PAM sequence:候選識別位點的毗鄰基序 adjacent motifs of candidate recognition sites;Target DNA:目標DNA。

3 釀酒酵母改造的目的和用途

3.1 提高釀酒酵母發酵性能

相對于野生型釀酒酵母,經過基因編輯技術改造的釀酒酵母可發酵產生更多的乙醇和番茄紅素。同時,改造后的酵母在發酵過程中能更有效地利用混合底物,并且表現出更強的耐高溫和乙醇耐受性,通過這些性能的提高,在發酵過程中釀酒酵母的性能將會表現得更加突出。Ye等[29]研究發現,通過TALENs技術敲除乙醇脫氫酶基因之后,釀酒酵母的乙醇產量提高到14.6 g/L,比之前報道的乙醇產量比例提高了(52.4±5.3)%,且明顯提高了釀酒酵母對乙醇的耐受性。孫玲等[30]利用CRISPR/Cas9基因編輯技術改造釀酒酵母,得到了多種甲羥戊酸途徑改變的高拷貝菌株(14～40個拷貝),過量表達N-末端截短的關鍵酶基因,將酶活提高了17.3倍,能夠更加高效地產生番茄紅素。

在發酵過程中,混合底物中葡萄糖濃度較高時,葡萄糖會被優先利用,產生葡萄糖阻遏效應,即在有氧條件下酵母細胞也由有氧呼吸轉變為無氧發酵產生大量乙醇,阻礙其他目標產物的生成[31]。因此,為了讓釀酒酵母更加高效地產生目標產物,必須阻斷細胞內葡萄糖阻遏效應,減少乙醇的通量。研究發現,核苷酸焦磷酸酶1(MTH1)基因編碼葡萄糖感應相關的轉錄調控因子,參與抑制菌株的葡萄糖敏感性,當底物只有葡萄糖時,輔酶A轉移酶(Ach1p)受到葡萄糖抑制而無法將線粒體中合成的乙酰輔酶A穿梭至胞質中,嚴重影響細胞的活性和生長,Oud等[32]通過刪除MTH1基因的225 bp序列,增強了葡萄糖耐受性,使其能在以葡萄糖為唯一碳源的條件下生長。此外,在釀酒酵母中,MIG1和SNF1被視為葡萄糖阻遏效應的關鍵因素,對解除葡萄糖阻遏產生顯著影響,當培養基中葡萄糖濃度較高時,轉錄因子MIG1會結合木糖代謝基因的啟動子區域,從而阻礙這些基因的轉錄,抑制木糖的代謝。通過基因編輯技術靶向去除葡萄糖阻遏效應關鍵基因SNF1,是提高木糖利用時間、重塑代謝途徑、減弱葡萄糖抑制效應、縮短發酵周期以及顯著提升發酵效率的重要途經[33]。

通過敲除手段進行遺傳改造還可以明顯提高釀酒酵母的耐熱性。酵母的耐熱性與轉錄因子絲氨酸-棕櫚酰轉移酶(stp23)有關,stp23在釀酒酵母的耐熱性中發揮著廣泛的作用,stp23可調節細胞中不飽和脂肪酸(ULA)含量,從而顯著影響細胞的耐熱性,且在45～55 ℃之間stp23的表達水平與耐熱性呈負相關[34-35],通過敲除相關基因(Sin3p、Srb2p和Mig1p)構建基因缺失株,改變轉錄調控網絡來提高釀酒酵母的耐熱性[36],通過各種遺傳工具改造可以使釀酒酵母有效地應對高溫、低pH和底物中存在的抑制性化合物[37-38]。

3.2 提高釀酒酵母活性氧耐受性

釀酒酵母對一定量的活性氧具有耐受性[39],在發酵過程中高濃度活性氧的存在會影響發酵的穩定性和效率。Yap1轉錄因子是決定釀酒酵母活性氧耐受能力的主要因素,其需要與Ybp1結合來表達其功能,此外,Yap1和Ybp1結合是氧化應激的限速步驟,調節Ybp1的表達有助于改變釀酒酵母對活性氧的耐受性[40]。通過CRISPR基因編輯技術構造Ybp1高表達的菌株、優化培養條件和添加抗氧化劑可以提高釀酒酵母的活性氧耐受性[41]。

3.3 生產功能性添加劑

通過基因編輯技術,釀酒酵母生產添加劑的產量有明顯提高。釀酒酵母細胞外壁結構特點之一是含有β-葡聚糖,改造前最高產量為58.2 mg/g[42],通過CRISPR基因編輯技術,使釀酒酵母菌株進行基因重組,同時優化發酵工藝參數,使用CRISPR/Cas系統敲除該合成途徑的關鍵基因glc3和alg5[43],切斷UDP-葡萄糖的消耗途徑,可使β-葡聚糖含量達到98.54 mg/g[28],而且還可以通過釀酒酵母本身的GLA系統,控制內切β-葡聚糖酶基因(eng1)表達,實現從頭合成低分子質量的β-葡聚糖,使β-葡聚糖更容易溶解被動物利用[44]。

4 釀酒酵母在動物生產中的應用

釀酒酵母作為優質的功能性與營養性飼料,被批準可以直接添加到動物飼糧中使用,在豬、畜禽和反芻動物中應用較為廣泛,在其他動物中也有少數應用[45]。釀酒酵母作為飼料添加劑具有改善犬腸道菌群穩態、抑制腸道病原菌增殖[46]、提高犢牛飼料原料消化利用率和提高犢牛血液中總蛋白和葡萄糖含量等功能[47]。同時,釀酒酵母還可以增強飼料適口性,改善動物消化能力,提高動物生產性能[48]。

4.1 在豬生產中的應用

在仔豬飼養中,飼糧中添加釀酒酵母可以作為抗生素替代物,提高斷奶仔豬的生長性能和養分消化率。研究表明,在仔豬飼糧中添加1%的釀酒酵母,結果顯示,該組的腹瀉指數最低,能夠有效緩解仔豬斷奶后和運輸的雙重應激反應,可以顯著提高斷奶仔豬的生長性能[49]。Jiang等[50]在斷奶仔豬的基礎飼糧中添加3.00 g/kg釀酒酵母,試驗第7天觀察發現試驗組斷奶仔豬十二指腸和空腸的絨毛高度和絨毛高度與隱窩深度比率顯著增加。除了提高生長性能、促進腸道發育,研究還發現,在仔豬飼糧中添加5.00 g/kg釀酒酵母還可調控仔豬腸道微生物組成,促進仔豬腸道有益菌的增殖,減少腹瀉現象的發生,以提高仔豬消化率,提高仔豬的生長性能[51-52]。

除仔豬外,釀酒酵母在生長育肥豬和母豬中也有一定的研究和應用。飼糧中添加酵母水解物可以提高生長育肥豬生長性能和營養物質消化率,調節腸道菌群平衡,提高機體免疫力。飼糧添加凝結芽孢桿菌和酵母水解產物,能夠提高生長育肥豬的生長性能和營養物質消化率,使豬后腸有益菌數量增加,提高機體的免疫力[53]。在母豬的飼糧中添加5%的釀酒酵母,可以提高母豬的生長性能和繁殖性能,同時起到減緩妊娠應激反應[54]。對生產的母豬來說,飼糧中添加5.00 g/kg釀酒酵母可以提高仔豬的初生重,顯著減少母豬產后奶水不足及產后感染的問題,減少母豬生殖道感染的比例,減輕母豬的產后應激反應[55]。相較而言,釀酒酵母在仔豬飼糧中的作用明顯高于生長育肥豬和母豬。

4.2 在禽類動物生產中的應用

有大量的研究已經證實,在禽類的飼糧中添加釀酒酵母可以改善其生長性能,調節腸道菌群,提高機體的免疫功能。Zhen等[56]研究表明,在肉雞的飼糧中添加0.8%～1.0%的釀酒酵母,能顯著提高瘤胃球菌屬(Ruminococcus)、丙酸桿菌科(Propionibacteriaceae)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的數量,從而改善肉雞的腸道微生物組成結構。胡芳等[57]研究表明,在蛋雞飼糧中適當添加釀酒酵母可以提高蛋雞的采食量及飼料轉化率,維持產蛋后期蛋雞的產蛋率,還能夠明顯提高蛋重及蛋品質。Mcbain等[58]研究表明,天冬氨酸有抗疲勞、改善心肌收縮等作用。在蛋雞的飼糧中加入0.6%和0.8%的釀酒酵母,顯著提高了雞蛋中天冬氨酸的含量,這表明添加釀酒酵母對功能性氨基酸的沉積有促進作用[59]。高文文等[60]以北京鴨為研究對象,在試驗組飼糧中添加1.2 g/kg的釀酒酵母,結果表明可改善北京鴨的生產性能,同時提高北京鴨的免疫和抗氧化能力。

4.3 在反芻動物生產中的應用

釀酒酵母不僅在單胃動物生產上有很好的應用效果,在反芻動物生產上應用也很廣泛。郭永清等[61]研究發現,在斷奶肉犢牛的飼糧中添加釀酒酵母(1%和2%,按干物質計),均能夠顯著提升其干物質采食量、平均日增重(ADG)、飼料轉化效率、瘤胃纖維素酶活性、瘤胃微生物蛋白水平、瘤胃丙酸與揮發性脂肪酸的濃度。Dann等[62]研究表明,在斷奶肉犢牛的飼糧中添加14 g/d釀酒酵母能夠提高ADG以及干物質和有機物的消化率。也有研究表明,在肉牛的飼糧中添加釀酒酵母30 g/(頭·d),可以提高牛肉的嫩度和風味,降低背最長肌的滴水損失[63]。

對于泌乳期的奶牛,在飼糧中添加釀酒酵母,可以提升奶牛產奶量,還可以降低其體重損失[64]。在夏季高溫環境中,在泌乳期奶牛的飼糧中添加釀酒酵母,能夠顯著提高奶牛的產奶量及牛奶中乳蛋白和乳糖含量[65]。在巴西夏季奶牛飼糧中補充酵母培養物,能夠降低奶牛的呼吸頻率、直腸溫度和皮膚溫度,防止奶牛體溫過高[66]。

在飼糧中添加釀酒酵母不僅對奶牛和肉牛有積極效果,對肉羊的生產也有很好的養殖效果。Malekkhahi等[67]研究表明,在俾路支雄性肉羔羊的飼糧中添加2×1010CFU/d的釀酒酵母可以顯著提高飼糧中性洗滌纖維和粗蛋白質的消化率。有研究表明,在2月齡健康湖羊公羔的飼糧中添加1%酵母培養物,提高羔羊對粗飼料的利用率[68]。挑選裝有瘤胃瘺管的健康薩能山羊為研究對象,在其飼糧中添加2%的酵母培養物,可以降低亞急性瘤胃酸中毒概率[69]。此外,添加10 g/d的釀酒酵母可提高育肥湖羊后期的生長性能和機體的健康程度[70]。

4.4 在水產動物生產中的應用

釀酒酵母及其衍生物在水產動物的飼料中也能產生健康益處。Adeoye等[71]研究發現,在非洲鯰魚飼料中添加3 g/kg的釀酒酵母,能對其生長發育起到促進作用。Hassaan等[72]在羅非魚飼料中添加釀酒酵母15 g/kg,發現肝細胞和絨毛發生改變,釀酒酵母在其體內產生酵母核苷酸,從而達到改善肝臟功能的目的,同時還可以促進羅非魚肝臟和腸道的恢復。

釀酒酵母在動物飼糧中的應用見表1。

表1 釀酒酵母在動物飼糧中的應用

5 小 結

隨著畜牧業的不斷發展以及發酵技術的不斷提高,釀酒酵母在動物生產領域使用頻率越來越高。釀酒酵母通過基因編輯技術改造,得到許多優勢高產菌株,但改造技術仍有許多需改進的地方,例如,CRISPR/Cas系統存在sgRNA效率不穩定[80]、CRISPR基因編輯技術脫靶概率很高和多編輯效率低[81-82]等問題,阻礙酵母改造的發展。近些年,合成生物學技術的快速發展和國內養殖業蛋白質飼料資源短缺,微生物飼料蛋白質成為生物工程制造研發的重點領域。未來合成生物學和基因編輯技術的結合將在釀酒酵母改造方面研究的越來越深入,使釀酒酵母改造變得更快捷、高效,能更加有效地生產目標產品,實現畜牧業持續健康綠色的發展。