牦牛胃溶菌酶抗小鼠腹瀉的研究

楊杜基 袁小迪 李 飆 張雨寒 孫鴻煒 劉益麗 袁國榮 江明鋒*

(1.西南民族大學畜牧獸醫學院,成都 610041;2.茂縣科學技術和農業畜牧局,茂縣 623200)

溶菌酶是由亞歷山大·弗萊明發現的一種具有溶解細菌能力的酶[1],廣泛存在于牛、羊、鹿等反芻動物和食葉猴以及麝雉的胃中,不過與大多數單胃動物不同,在反芻動物胃中表達的溶菌酶主要發揮消化酶的作用[2-4],主要功能是破壞瘤胃微生物發酵產生的大量菌體的細胞壁,釋放其中的菌體蛋白供反芻動物消化吸收。與通常的溶菌酶不同,反芻動物的胃溶菌酶主要由皺胃分泌,為了適應皺胃中富含胃酸和胃蛋白酶的特殊環境,該酶通過適應性進化增加了對胃中酸性環境的適應和對胃蛋白酶的抗性[5]。研究表明,與普通溶菌酶相比,反芻動物胃溶菌酶氨基酸序列中發現6個氨基酸替換,即14號位賴氨酸/谷氨酸(Lys/Glu14)、21號位賴氨酸/谷氨酸(Lys/Glu21)、50號位谷氨酸(Glu50)、75號位天冬酰胺(Asp75)、87號位天冬酰胺(Asn87)、126號位賴氨酸/谷氨酸(Lys/Glu126)。此外,與非胃溶菌酶相比,其氨基酸序列中精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)殘基的數量較少且結構中不存在天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)鍵;這些進化適應使得反芻動物胃溶菌酶能抵抗胃中的酸性環境并發揮活性[5]。與單胃動物相比,反芻動物擁有更多溶菌酶基因,且在皺胃中高水平表達并發揮消化酶功能[6-11],使反芻動物能夠利用植物材料作為食物來源[12]。

家畜的細菌性腹瀉損害家畜胃腸消化和營養吸收功能,進而降低養殖業的效益。臨床上發生腹瀉后常采用抗生素進行治療。此外,在家畜養殖業中為預防腹瀉提高養殖效益,常在飼糧中添加抗生素以提高動物抵抗力。但抗生素濫用引起了嚴重的抗生素殘留和微生物耐藥性問題,甚至出現超級細菌[13]。2020年農業農村部頒布第194號公告,飼料生產企業停止生產含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料,我國正式迎來飼料無抗時代。但“禁抗、減抗、限抗”政策給養殖業帶來了挑戰。因此,尋找飼用抗生素替代品,成為當前研究熱點[14]。反芻動物胃溶菌酶有抗胃蛋白酶、抗胰蛋白酶、耐高溫、適應胃酸環境等特點,從而避免了普通溶菌酶進入動物消化道后,在胃蛋白酶的作用下快速降解無法到達腸道發揮作用的缺點。因此,反芻動物胃溶菌酶具備替代飼料抗生素作為新一代抗腹瀉飼料添加劑的潛力。目前市場上已經將普通溶菌酶作為飼料添加劑進行銷售,據報道飼糧添加溶菌酶可顯著提高斷奶仔豬血漿總蛋白以及球蛋白含量,提高仔豬免疫力,有效提高仔豬的生長性能[15]。但普通溶菌酶會在胃中被降解,因此不能過胃入腸發揮抗腹瀉功能。本課題組前期研究表明,從反芻動物皺胃黏膜中提取胃溶菌酶成本較高,獲取量極低,難以在生產中得到應用。因此,通過基因工程技術大量生產溶菌酶是反芻動物胃溶菌酶產業化的必由之路,這將為我國飼料禁抗后提高家畜養殖效益作出貢獻。

此前研究發現,高原反芻動物胃溶菌酶比非高原溶菌酶表現出更強的酶活,且該酶對pH、溫度、胃蛋白酶和胰蛋白酶以及環境因素的耐受性更強[6];幾種高原反芻動物胃溶菌酶均可過胃入腸發揮殺菌抗腹瀉作用。此外,高原反芻動物胃溶菌酶還具備較好的抗胰蛋白酶和抗高溫能力,能適應飼料加工過程中的加溫加壓過程[16]。溶菌酶對動物機體無毒、無殘留,能殺死腸道致病菌,增強腸道抵抗力,防治動物腹瀉,促進動物消化和營養吸收。Harpold和Brierley在畢赤酵母中成功表達黃牛胃溶菌酶C2,發酵液中重組溶菌酶濃度最高超過550 mg/L,在連續培養中重組溶菌酶濃度達到350 mg/L[17]。因此,用基因工程菌株生產反芻動物胃溶菌酶并將其作為飼料添加劑可應用于畜禽生產領域。

本研究使用致病性大腸桿菌O111感染昆明小鼠,建立小鼠腹瀉模型,用純化的牦牛胃溶菌酶和重組表達的牦牛胃溶菌酶對攻毒小鼠進行治療;對牦牛胃溶菌酶對小鼠腹瀉的治療效果進行評價,以期為牦牛胃溶菌酶作為飼料添加劑奠定基礎。同時進一步考慮將其應用到家畜細菌性腹瀉疾病治療領域,促進家畜養殖業的發展,該酶在飼料抗生素替代領域有著及其重要的價值和廣闊的應用前景。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麥洼牦牛皺胃黏膜、藏黃牛皺胃黏膜采集自四川省阿壩藏族羌族自治州茂縣;麥洼牦牛胃溶菌酶基因(GenBank: KR186168.1)為本實驗室克隆;PichiaPinkTM畢赤酵母表達系統菌株、pPinkɑ-HC表達載體購自Thermo Fisher公司。

1.2 牦牛胃溶菌酶的分離純化

皺胃黏膜勻漿的制備:稱取適當重量的牦牛和藏黃牛的皺胃黏膜放入勻漿器勻漿處理;勻漿液離心滅菌處理后用冰醋酸調節pH至4,再用氨水(10 mmol/L醋酸銨溶液,pH=6)進行粗純化。將SP Sepharose HP柱安裝于快速蛋白液相色譜儀(AKTA)上,用0.25 μm過濾器過濾粗純液,收集流穿液,用起始緩沖液平衡液(pH=5.8的10 mmol/L醋酸銨)以1 mL/min的流速平衡分離柱,直到基線及電導穩定。用洗脫緩沖液(300 mmol/L醋酸銨,pH=8,含1 mmol/L NaCl)以1 mL/min的流速進行洗脫,收集含有胃溶菌酶的溶液。

1.3 重組胃溶菌酶的真核表達

牦牛胃溶菌酶基因(LYZ-1a)從pPICZαA-sLYZ質粒中擴增,將牦牛胃溶菌酶基因序列(LYZ-1a)送往上海生工生物公司合成。合成的牦牛胃溶菌酶基因序列(LYZ-1a)大小為444 bp。按表1的酶切體系用StuI和KpnI對擴增出的LYZ-Y-1a片段和pPinkα-HC vector進行雙酶切,回收酶切后的LYZ-Y-1a基因片段和pPinkα-HC載體片段。連接回收后的LYZ-Y-1a基因片段和pPinkα-HC載體片段,得到重組質粒pPinkα-HC-LYZ-Y-1a。重組質粒pPinkα-HC-LYZ-Y-1a轉化大腸桿菌并擴增提取,用AflⅡ線性化重組質粒,轉化酵母菌感受態細胞,得到表達牦牛胃溶菌酶的重組酵母菌基因工程菌。鑒定正確的單克隆菌株進行小規模誘導培養,誘導表達96 h后,收集上清液,經過TCA沉淀再進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析。

1.4 胃溶菌酶抗小鼠腹瀉研究

選用健康、同齡、無特定病原體(SPF)級昆明小鼠作為試驗鼠。正常飼糧飼養3 d后,隨機挑選10只小鼠分為腹瀉模型組和對照組,每組5只,接種大腸桿菌前禁食12 h,對照組注射300 μL生理鹽水,腹瀉模型組注射300 μL的致病性大腸桿菌O111懸液(濃度3.6×108CFU/mL)建立腹瀉模型。

腹瀉模型建成后,另取30只SPF級雄性昆明小鼠隨機分為6組,每組5只,分為對照組(DZ組)、腹瀉模型組(FX組)、抗生素治療組(KSS組)、重組牦牛胃溶菌酶組(RYSL組)、牦牛胃溶菌酶組(YSL組)、溶菌酶產品(酶活性為50 U/mg)治療組(AKY組)。飼喂4 d后進行攻毒,DZ組腹腔注射300 μL的無菌生理鹽水,其余各組均注射300 μL的大腸桿菌O111懸液(濃度3.6×108CFU/mL)。攻毒24 h后,DZ組小鼠灌服200 μL的生理鹽水;腹瀉模型組小鼠灌服200 μL生理鹽水;KSS組小鼠灌服200 μL的氨芐西林鈉生理鹽水溶液(濃度為50 g/L);RYSL組小鼠灌服200 μL的重組牦牛胃溶菌酶溶液(濃度為15 000 U/mL);YSL組小鼠灌服200 μL的分離純化牦牛胃溶菌酶溶液(濃度為15 000 U/mL);AKY組小鼠灌服200 μL的溶菌酶添加劑(濃度為15 000 U/mL)。以上各組每隔12 h給藥1次,記錄小鼠的采食量、體重和腹瀉情況,同時對試驗小鼠進行血常規分析、病理學解剖、觀察腸道組織的變化情況,同時對腸道微生物進行Alpha和Beta多樣性分析。

1.5 血常規檢測

試驗第4天時,灌胃結束以后,按照分組對每只小鼠摘眼球采血(試驗操作符合動物倫理),用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管收集全血,測定白細胞數、淋巴細胞數和中性粒細胞數。

1.6 腸道組織切片制作及病理檢測

試驗第4天時,采血后所有小鼠頸椎脫臼致死、剖檢(試驗操作符合動物倫理),取十二指腸相同部位(2 cm)于4%多聚甲醛溶液中固定。1)脫水:75%酒精3 h,85%酒精1 h,95%酒精1 h 20 min,100%酒精Ⅰ25 min,100%酒精Ⅱ20 min,100%酒精Ⅲ 20 min。2)透明處理:100%酒精和二甲苯混合(比例1∶1)20 min,二甲苯Ⅰ15 min,二甲苯Ⅱ15 min。3)浸蠟:石蠟Ⅰ1 h,石蠟Ⅱ2 h,石蠟Ⅲ3 h。4)送里來醫學生物中心進行石蠟包埋,切片,蘇木精-伊紅(HE)染色,光學顯微鏡下觀察。

1.7 小鼠腸道菌群檢測及16S rRNA多樣性分析

小鼠頸椎脫位處死后,用無菌設備取出腸道內容物,稱取0.2 g腸道內容物放入無菌離心管中,放置超低溫冰箱。所獲得的小鼠腸道微生物分組編號后送往美吉生物公司檢測,包括16S rRNA的PCR擴增。

1.8 統計與分析

本試驗所有的數據均采用SPSS 20.0統計軟件進行分析,所有的計量資料均服從正態分布。統計分析過程中的正態分布資料的2個獨立樣本采用t檢驗分析,單一數據采用卡方分析,多個獨立樣本采用方差分析,組間方差齊采用LSD檢驗,方差不齊采用Kruskal-Wallis H檢驗。P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 牦牛胃溶菌酶的分離純化

牦牛皺胃黏膜經勻漿粗純化后,用陽離子交換柱SP-Sepharose HP分步洗脫,測定洗脫后蛋白溶液的吸光度(圖1-a)。根據洗脫峰分步收集蛋白洗脫液,并測定溶菌酶活性。結果表明,目標蛋白出現在洗脫波峰對應的收集管中(圖1-a箭頭標記處)。將分離純化的牦牛胃溶菌酶進行SDS-PAGE分析(圖1-b),泳道1和2中只顯示1條蛋白條帶,與Marker分子質量比較,推斷出牦牛和藏黃牛胃溶菌酶的分子質量均約為15 ku。陽性克隆發酵上清接入BMMY培養基中進行表達,發酵上清液經TCA濃縮、SDS-PAGE電泳后,SDS-PAGE電泳結果(圖1-c)顯示,誘導表達后的牦牛胃溶菌酶分子質量大小約15.6ku。對所提取的重組質粒pPinkα-HC-LYZ-Y-1a用Kpn Ⅰ進行雙酶切,重組質粒pPinkα-HC-LYZ-Y-1a用Afl Ⅱ線性化后進行瓊脂糖凝膠電泳。結果(圖1-d)顯示,重組質粒發現大小約444 bp的酶切后產物,與理論大小相符。

a:牦牛胃溶菌酶SP-Sepharose HP柱層析洗脫圖 ;b:牦牛胃溶菌酶分離純化SDS-PAGE分析; c: 陽性克隆發酵上清SDS-PAGE圖; d: 重組質粒pPinkα-HC-LYZ-Y-1a的單/雙酶切驗證。a: elution diagram of yak stomachlysozyme SP-Sepharose HP column chromatography division; b: SDS-PAGE analysis of yak stomachlysozyme isolation and purification; c: SDS-PAGE map of the positive clone fermentation supernatant; d: recombinant plasmid pPinkα-HC-LYZ- Y-1a single/double enzyme digestion verification.

2.2 小鼠采食量的測定

由表2可知,試驗開始前3天小鼠處于靜養去應激階段,小鼠自由采食。試驗開始除DZ組外其余各組均腹腔注射致病性大腸桿菌O111攻毒并開始測定采食量,第2天,FX組和AKY組采食量顯著低于DZ組(P<0.05),其余各組均無顯著差異(P>0.05)。第3天,FX組和AKY組采食量顯著低于DZ組(P<0.05),其余各組均無顯著差異(P>0.05)。第4天,FX組采食量極顯著低于DZ組(P<0.01),AKY組采食量與對照組相比差異顯著(P<0.05),其余各組均無顯著差異(P>0.05)。

表2 小鼠采食量

2.3 小鼠體重變化

攻毒后給藥治療3 d,各組小鼠的體重變化由表3可知,DZ組小鼠的體重每日增加。與DZ組相比,FX組小鼠體重呈下降趨勢,在第7天體重差異顯著(P<0.05);與FX組相比,KSS組、RYSL組、YSL組的小鼠體重在第4天攻毒后均出現明顯的下降趨勢,第6天治療后體重明顯呈上升趨勢,均具有一定的治療效果。而AKY組體重呈緩慢下降趨勢,在第7天體重與DZ組相比顯著降低(P<0.05),治療效果不如其他組明顯。

2.4 小鼠血常規變化

由表4可知,與DZ組相比,FX組白細胞數、淋巴細胞數和中性粒細胞數均有極顯著升高(P<0.01);AKY組白細胞數極顯著升高(P<0.01),淋巴細胞數顯著升高(P<0.05),其余各組血常規數據均無顯著差異(P>0.05)。

表4 小鼠血常規分析

2.5 小鼠腸道組織病理變化情況

觀察到DZ組小鼠腸絨毛結構完整,絨毛長度、隱窩深度和腸壁厚度均為正常(圖2-A);YSL組腸絨毛長度較DZ組有所增長且厚度增加,隱窩深度變深,腸壁增厚(圖2-B);與FX組相比,RYSL組腸絨毛有所恢復,但不如前2組小鼠絨毛整齊,小腸絨毛有輕微的斷裂現象,治療效果較顯著(圖2-C);FX組可觀察到腸絨毛出現萎縮,腸腔內存有脫落的腸絨毛部分,杯狀細胞增多,隱窩較淺,腸壁厚度變薄,腸絨毛和腸腺有出血(圖2-D);FX組腸壁增厚明顯,腸絨毛厚度和長度較DZ組有明顯增加,隱窩深度變深(圖2-E);AKY組腸絨毛出現萎縮并有脫落情況出現,有少量杯狀細胞,腸絨毛有少量出血且長度變短,隱窩深度變淺,腸壁厚度明顯變薄(圖2-F)

A:對照組;B:牦牛胃溶菌酶組;C:重組牦牛胃溶菌酶組;D:腹瀉模型組;E:抗生素治療組;F:溶菌酶產品治療組。

2.6 小鼠腸道菌群的分析

2.6.1 Alpha多樣性分析

由表5可知,與DZ組相比,FX組小鼠的Sobs指數和Chao指數均有所增高且有顯著差異(P<0.05),Ace指數極顯著增加(P<0.01),Simpson指數有所減小且差異顯著(P<0.05);YSL組和RYSL組的Simpson指數顯著增加(P<0.05)。

表5 小鼠腸道菌群Alpha分析

通過主坐標分析(PCoA)和非度量多維尺度分析(NMDS)可以比較各組小鼠腸道菌群群落結構的差異。由PCoA圖(圖3-A)可知,FX組和AKY組的菌群結構與DZ組存在明顯差異,其余各組小鼠的腸道菌群結構接近于DZ組。NMDS圖(圖3-B)也表明,FX組和AKY組的菌群結構與DZ組有明顯差異,使用牦牛胃溶菌酶和重組牦牛胃溶菌酶以及抗生素進行治療會對腹瀉小鼠腸道的菌群結構產生明顯的影響。

A:主坐標分析圖;B:非度量多維尺度分析圖。A:principal co-ordinates analysis diagram; B:non-metric multidimensional scaling-analysis diagram.

2.6.2 小鼠腸道菌群門水平分析

由表6可知,小鼠腸道菌群的優勢門有:厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteriota)、彎曲桿菌門(Campilobacterota)、硫桿菌門(Desulfobacterota)、其他細菌門類,相對豐度平均值分別為65.34%、25.83%、4.36%、2.16%、1.18%、0.53%、0.60%。

表6 小鼠腸道菌群門水平的相對豐度

通過序列比對獲得各組小鼠腸道菌群相對豐度較高的前5個菌門,各組小鼠腸道菌群的門水平聚類分析熱圖如圖4所示。結合圖4和表6可知,與DZ組相比,FX組的變形菌門和彎曲桿菌門相對豐度顯著增加(P<0.05),厚壁菌門、擬桿菌門和放線菌門的相對豐度顯著降低(P<0.05)。與DZ組相比,AKY組變形菌門、擬桿菌門和彎曲桿菌門相對豐度顯著增加(P<0.05),厚壁菌門和放線菌門相對豐度顯著降低(P<0.05),RYSL組和YSL組的厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度有所增加,但差異不顯著(P>0.05)。

2.6.3 小鼠腸道菌群屬水平分析

圖5顯示了小鼠腸道菌群相對豐度較高的20個菌屬,其中有6個菌屬的相對豐度大于1%。這6個相對豐度較高的菌屬分別為未分類的穆里桿菌科(norank_f_Muribaculaceae)、穆里桿菌科(Muribaculaceae)、埃希氏-志賀氏菌屬(Escherichia-shigella)、擬普雷沃氏菌屬(Allopervotella)、拉氏桿菌科(Lachnospiraceae)和羅氏菌屬(Roseburia)。各組小鼠腸道菌群屬水平聚類分析熱圖如圖7所示,與DZ組相比,FX組的埃希氏-志賀氏菌屬和穆里桿菌科相對豐度顯著增加(P<0.05),乳桿菌屬(Lactobacillus)、擬普雷沃氏菌屬和拉氏桿菌科的相對豐度顯著降低(P<0.05)。與DZ組相比,AKY組埃希氏-志賀氏菌屬和穆里桿菌科相對豐度顯著增加(P<0.05),乳桿菌屬、羅氏菌屬和拉氏桿菌科相對豐度顯著降低(P<0.05)。

Lactobacillus:乳桿菌屬;norank_f_Muribaculaceae:未分類的穆里桿菌科;Escherichia-Shigella:埃希氏-志賀氏菌屬;Alloprevotella:擬普雷沃氏菌屬;Lachnospiraceae_NK4A136_group:拉氏桿菌科NK4A136群;Roseburia:羅氏菌屬;Alistipes:另枝菌屬;norank_f_Lachnospiraceae:未分類的拉氏桿菌科,Bacteroides:擬桿菌屬;Enterorhabdus:腸桿菌屬;unclassified_f_Lachnospiraceae:未鑒別的的拉氏桿菌科;Helicobacter:螺桿菌屬;Lachnoclostridium:拉克氏梭菌屬;Lachnospiraceae_UCG-006:毛螺菌科UCG-006;Prevotellaceae_UCG-001:普雷沃氏菌科UCG-001; Anaerotruncus:厭氧菌屬;Desulfovibrio:脫硫弧菌屬;Blautia:經黏液真桿菌屬;Rikenellaceae_RC9_gut_group:理研菌科RC9腸道群;others:其他。

與DZ組相比,RYSL組和YSL組的乳桿菌屬相對豐度有所增加,但差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

家畜腹瀉是一種常見疾病,影響家畜健康及生長。在犢牛腹瀉中發現的常見病原體包括隱孢子蟲、輪狀病毒、冠狀病毒、沙門氏菌、黏附和黏附大腸桿菌(EHEC、EPEC、STEC)和F5 (K99)大腸桿菌[18]。在家畜養殖業中長期大量使用抗生素不但使動物產生耐藥性而且抗生素殘留還可能對人類的健康存在威脅,因此迫切需要開發抗生素替代品。有研究表明,溶菌酶作為天然的抗菌物質,可以作為抗生素替代物治療動物腹瀉[19]。引起成年反芻動物感染性腸炎的病原有細菌、病毒和寄生蟲。感染性腸炎最常見的臨床癥狀為腹瀉[20]。本研究中建立的小鼠腹瀉模型,發現腹瀉小鼠腸道菌群結構發生改變,牦牛胃溶菌酶給藥能減輕小鼠腹瀉癥狀,可能是牦牛胃溶菌酶通過調節腸道菌群結構及增強腸道免疫改善了腸道健康。

PichiaPinkTM畢赤酵母表達系統使通過顏色選擇轉化的菌落變得容易。未轉化的PichiaPinkTM菌株會形成粉色菌落。當在不含腺嘌呤的平板上生長時,轉化的PichiaPinkTM菌株會形成白色菌落。PichiaPinkTM酵母表達系統基于的酵母菌是畢赤酵母。畢赤酵母的優點包括快速生長、明確的遺傳背景、簡單的培養基配方和易于處理[21]。其表達的產物糖基化程度低、蛋白質活性高,更適合于高等生物基因的大量表達[22]。

腸道微生物群對宿主的健康具有重要作用[23],與宿主的免疫、代謝、消化、吸收和對疾病的易感性都密切相關。瘤胃中發酵產生的微生物在皺胃中被溶菌酶分解,以暴露前胃發酵形成的菌體蛋白,這些被分解的菌體蛋白在腸道內被吸收。在反芻動物中,防御性溶菌酶已轉化為消化酶,以消化復胃中通過發酵產生的微生物蛋白,并將菌體蛋白作為營養提供給反芻動物[24]。目前關于重組牦牛胃溶菌酶治療腹瀉疾病及改善動物腸道菌群的研究較少,而重組雞蛋清溶菌酶和重組人溶菌酶相關研究較多。研究表明,重組牦牛溶菌酶可改變腸道微生物菌群,改善動物的胃腸道健康[25-26]。因此,對重組牦牛胃溶菌酶研究和開發具有巨大的價值。本課題組在3種青藏高原反芻動物胃溶菌酶催化性能的比較研究中表明,重組牦牛胃溶菌酶(rysLYZ)比雞和人溶菌酶更能抵抗胰蛋白酶失活,牛、牦牛和綿羊分別保留了其初始溶菌酶活性的29%、59%和96%,雞和人的溶菌酶分別保留了初始活性的7%和6%[6]。這表明反芻動物溶菌酶比雞和人溶菌酶更能抵抗胰蛋白酶失活。與普通溶菌酶相比,反芻動物胃溶菌酶的這一特性使得其更具有代替抗生素治療家畜細菌性腹瀉的潛力。牦牛胃溶菌酶具有抗菌活性,對金黃色葡萄球菌具有裂解活性[23]。

本研究對重組牦牛胃溶菌酶抗腹瀉能力進行研究,以小鼠為試驗對象,通過大腸桿菌O111建立腹瀉模型。研究不同治療方案對小鼠腸道組織形態、血液生化指標以及微生物豐度和多樣性的影響。結果表明,大腸桿菌O111攻毒24 h后,除DZ組小鼠外,其他各組小鼠精神狀態消沉,采食量減少,體重有所減輕;從腸道組織病理切片來看,腹瀉模型組小鼠腸壁明顯變薄,小腸組織排列紊亂,絨毛斷裂嚴重,絨毛上皮細胞腫脹,腸上皮細胞損傷并且絨毛長度降低;從血常規檢測結果來看,FX組小鼠白細胞數與DZ組相比差異極顯著;Alpha多樣性分析和Beta多樣性分析表明,腹瀉小鼠腸道菌群相對豐度和多樣性均降低,在RUSL組和YSL組治療后,Shannon、Chao和ACE指數均比DZ組高,表明腸道微生物的物種豐度增加,菌群豐度顯著恢復。其中,牦牛胃溶菌酶變化最為明顯。PCoA也進一步顯示,各組腸道菌群具有較高的穩定性,且在菌群結構上具有顯著差異。本試驗研究了腸道菌群在門、屬水平上的分布,在RYSL組和YSL組治療后厚壁菌門相對豐度比FX組明顯增加;RYSL組和YSL組與FX組比較,變形菌門相對豐度減少,變形菌門被認為是腸道菌群失調的標志[27],腸道中大量的變形菌門反映了發育遲緩或腸道菌群結構不穩定;通過灌喂牦牛胃溶菌酶和重組牦牛胃溶菌酶改變了小鼠腸道菌群的屬結構。通過研究屬水平的聚類分析熱圖,本研究發現,在屬水平上,腹瀉小鼠腸道內菌群與對DZ相比埃希氏-志賀氏菌屬相對豐度有明顯的增高,乳桿菌屬相對豐度明顯降低,這也能表明致病性大腸桿菌在腹瀉小鼠腸道內的大量繁殖影響到腸道內有益菌的豐富度。RYSL和YSL組小鼠腸道內的埃希氏-志賀氏菌屬已經不是優勢屬類,而且其小鼠腸道內的乳桿菌屬相比DZ組有所增加,表明溶菌酶不僅可以殺滅和抑制腸道內致病性大腸桿菌的生長,還能促進腸道內益生菌群的繁殖。這表明灌服重組牦牛胃溶菌酶和牦牛胃溶菌酶對小鼠腹瀉有明確的治療的效果。

4 結 論

灌服重組牦牛胃溶菌酶和牦牛胃溶菌酶對由大腸桿菌菌株引起的小鼠腹瀉有明確的防治效果。同時,通過研究腸道內絨毛長度和菌群豐富度可以看出重組牦牛胃溶菌酶和牦牛胃溶菌酶還有促進腸道修復損傷、增加腸道內益生菌數目的作用,因此,本試驗認為重組牦牛胃溶菌酶或通過生化方法提取的原酶具有作為家畜抗腹瀉飼料添加劑的潛力。