沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿生化、免疫、抗氧化和激素指標的影響

李華北 段嘉鈺 蔣林樹 敖長金* 白 晨*

(1.內蒙古農業大學動物科學學院,內蒙古自治區高校動物營養與飼料科學重點實驗室,呼和浩特 010018;2.北京農學院動物科學技術學院,北京農學院奶牛營養學北京市重點實驗室,北京 102208)

奶牛氧化應激受到自身及外界多種因素的影響。氧化應激能夠引起機體功能紊亂,甚至免疫系統損傷,從而降低機體免疫功能。奶牛氧化應激及炎癥反應對奶牛機體的損傷更增加了奶牛對疾病的感染風險,進一步引發奶牛乳房炎及生殖障礙,嚴重地降低了高產奶牛的生產性能及利用年限[1]。盧德勛[2]系統地提出氧化應激-炎癥反應-免疫功能失衡之間的聯系,并總結出一個問題三個互相聯動方面的理論,揭示了氧化應激是在動物生產中引起炎癥反應、免疫功能失衡的重要影響因素。隨著我國奶牛養殖業集約化、規模化進程的不斷加快,奶牛單產水平不斷提高,隨之而來的是高產奶牛體內代謝壓力劇增,尤其在泌乳高峰期代謝最為旺盛,更易給個體帶來氧化應激的問題[3]。

部分植物提取物具有提高奶牛機體抗氧化、抗炎及免疫能力的顯著功效,因此被研究者廣泛研究。沙蔥是我國西北半荒漠地區特有的蔥屬植物,廣泛分布于內蒙古、陜西、甘肅等省份。沙蔥及其提取物被證實具有調節反芻動物免疫力[4]、抗氧化能力[5]、抗炎[6]和促進生長[7]等生物學功能,特別是其對消除羊肉的膻味具有獨特效果[8]。沙蔥常見粗提物類型包括沙蔥乙醇類提取物[9]、多糖類提取物[10]、精油類提取物[11]。有學者利用超高效液相色譜分析發現,沙蔥的乙醇提取物中富含黃酮類、有機酸類、核苷酸類等多種生物活性物質[4]。目前,沙蔥提取物對肉羊的免疫、抗氧化能力的影響及機制研究已經較為深入,但對奶牛的影響尚不明確。因此,本試驗旨在通過在飼糧中添加沙蔥乙醇提取物,探究其對泌乳中期奶牛血漿生化、免疫、抗氧化和激素指標的影響,以期豐富沙蔥提取物生物活性功能的系統研究,并為其在奶牛生產中的應用提供科學基礎。

1 材料與方法

1.1 沙蔥乙醇提取物的制備

鮮沙蔥購買于內蒙古自治區阿拉善左旗,65 ℃烘干、粉碎后備用。沙蔥乙醇提取物采用超聲波提取工藝,使用75%乙醇在真空條件下蒸發濃縮,將濃縮液制備成凍干粉末,具體提取過程參考薩茹麗[12]優化的沙蔥乙醇提取物制備方法。沙蔥乙醇提取物的得率為28%,其主要活性成分及含量分別為:黃酮類(26.43%)、有機酸及其衍生物(18.57%)、核苷酸及其衍生物(14.43%)、氨基酸(11.14%)、羥基肉桂酰衍生物(4.43%)、氨基酸類衍化物(3.14%)、酚胺(2.35%)、維生素(1.55%)、膽堿(1.00%)、脂類(7.22%)等[4]。

1.2 試驗設計與飼養管理

試驗地點位于內蒙古自治區巴彥淖爾市杭錦后旗(經度:E106°34′～107°24′,緯度:N40°26′～41°13′)。選取12頭2～3胎次、體況和泌乳量相近、處于泌乳中期的健康荷斯坦奶牛,體重(605.92±11.30) kg。采用單因素隨機試驗設計,將12頭奶牛隨機分為2組,每組6個重復,每個重復1頭。對照組奶牛飼喂基礎飼糧,試驗組奶牛飼喂基礎飼糧+54 g/d沙蔥乙醇提取物。沙蔥乙醇提取物飼喂劑量依據課題組體外瘤胃液培養試驗及奶牛干物質采食量計算得出[13]。每天采用灌服的方式飼喂沙蔥乙醇提取物,以確保奶牛完全采食規定劑量的沙蔥乙醇提取物。試驗共持續56 d,包括預試期14 d,正試期42 d。每天02:00、14:00投喂飼料,每天01:30、09:00、16:00擠奶。試驗期間奶牛自由采食、飲水和活動,同時保持牛舍潔凈。

1.3 飼糧組成及營養水平

基礎飼糧依據NRC(2001)[14]奶牛飼養標準配制,其組成及營養水平如表1所示。飼糧中干物質、粗蛋白質、粗脂肪含量按照GB/T 18868—2002[15]進行測定,中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量采用范氏(Van Soest)方法進行測定,粗灰分、鈣、磷含量分別按照GB/T 6438—2007[16]、GB/T 6436—2018[17]、GB/T 6437—2018[18]進行測定,泌乳凈能(NEL)依據NRC(2001)[14]數據計算獲得。

表1 基礎飼糧組成及營養水平(干物質基礎)

1.4 樣品采集

在正試期第42天,以頸靜脈采血的方式采集每頭奶牛血液40 mL,利用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝采血管收集,在1 295×g條件下離心10 min,得到血漿,放入1.5 mL離心管,于-20 ℃保存備用。

1.5 測定指標與方法

1.5.1 血漿生化指標

測定血漿總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、肌酐(CR)、膽固醇(CHOL)、葡萄糖(GLU)、尿素(UREA)含量及谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)活性,試劑盒均購于北京樂普生物科技有限公司,測定步驟嚴格按照試劑盒產品說明書操作方法進行操作,使用全自動血液生化分析儀(日立3110,Hitachi公司,日本)進行檢測。

1.5.2 血漿抗氧化指標

測定血漿過氧化氫酶(CAT)(鉬酸銨法)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(比色法)、超氧化物歧化酶(SOD)(羥胺法)活性和谷胱甘肽(GSH)(微板法)、丙二醛(MDA)(TBA法)含量及總抗氧化能力(T-AOC)(ABTS法),試劑盒均購于南京建成生物工程研究所,測定步驟嚴格按照試劑盒產品說明書操作方法進行操作,利用酶標儀(SYNERGY-H1,BioTek公司,美國)進行檢測。

1.5.3 血漿免疫指標

測定血漿免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、白細胞介素-2(IL-2)、白細胞介素-6(IL-6)、白細胞介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)含量,試劑盒均購于江蘇晶美生物科技有限公司,測定步驟嚴格按照試劑盒產品說明書操作方法進行操作,利用酶標儀(SYNERGY-H1,BioTek公司,美國)進行檢測。

1.5.4 血漿激素指標

測定血漿生長激素(GH)、催乳素(PRL)、雌二醇(E2)、胰島素(INS)、皮質醇(HYD)含量,試劑盒均購于江蘇晶美生物科技有限公司,測定步驟嚴格按照試劑盒產品說明書操作方法進行操作,利用酶標儀(SYNERGY-H1,BioTek公司,美國)進行檢測。

1.6 數據統計與分析

試驗數據使用WPS 2022進行初步整理統計后,使用SAS 9.2軟件中t檢驗進行分析,結果以平均值和均值標準誤(SEM)的形式表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿生化指標的影響

據表2可知,試驗組的血漿GLU、TP、ALB、GLB、CR、CHOL含量均高于對照組,UREA含量和ALT、AST、ALP活性均低于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表2 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿生化指標的影響

2.2 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿抗氧化指標的影響

據表3可知,試驗組的血漿GSH含量和GSH-Px活性顯著高于對照組(P<0.05),且血漿SOD活性極顯著高于對照組(P<0.01)。試驗組的血漿T-AOC高于對照組,血漿CAT活性和MDA含量低于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表3 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿抗氧化指標的影響

2.3 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿免疫指標的影響

據表4可知,試驗組的血漿IL-2和IL-10含量顯著高于對照組(P<0.05),血漿IL-6含量極顯著低于對照組(P<0.01)。試驗組的血漿IgG、IgM、IFN-γ含量高于對照組,血漿IgA、TNF-α含量低于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。

表4 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿免疫指標的影響

表5 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿激素指標的影響

2.4 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿激素指標的影響

據表4可知,試驗組的血漿GH、PRL、E2含量低于對照組,血漿INS、HYD含量高于對照組,但2組之間差異均不顯著(P>0.05)。

3 討 論

3.1 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿生化指標的影響

血漿生化指標能夠直接或間接反映機體內環境穩態以及機體各組織器官之間功能表達[19],其中血漿GLU含量在一定程度上能夠反映機體糖代謝狀況,血漿UREA含量降低反映機體對氮的利用率提高。有研究發現,奶牛在泌乳階段易出現能量負平衡現象,主要變化之一便是GLU含量降低(GLU含量<2.5 mmol/L)[20]。本試驗中,沙蔥乙醇提取物能夠提高泌乳中期奶牛血漿GLU含量,同時降低血漿UREA含量。其原因可能是沙蔥乙醇提取物促進瘤胃微生物繁殖,增加原蟲數量以及促進瘤胃微生物蛋白的合成,促進機體對蛋白質的吸收利用,提高機體對氮的利用率,同時促進碳水化合物向丙酸發酵模式的轉變,為機體提供能量[21]。有研究表明,沙棘黃酮能夠提高羊血清GLU含量,降低血清尿素氮(UN)含量[22],與本試驗結果相同。

GLB是機體主要的免疫性蛋白質,包括IgG、IgM、IgA等多種免疫球蛋白,是組成機體體液免疫的重要物質,同時能夠刺激淋巴系統消除病原體對機體的危害[23]。本試驗結果表明,沙蔥乙醇提取物能夠提高機體血漿GLB含量,說明沙蔥乙醇提取物具有調節機體免疫的作用。這與諸多關于植物提取調節機體免疫的報道結果相同[24]。ALP是機體對鈣、磷吸收機能變化的敏感指標,能反映出機體骨骼的發育狀態,當其活性升高表明動物鈣離子代謝出現異常,機體骨骼代謝紊亂,造成骨骼疾病發生[25]。本試驗中,沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿中ALP活性無顯著影響,且ALP活性在正常范圍內。腎臟、肝臟是機體重要的解毒器官,有著重要的解毒防御作用。CR是一種存在于血液中的外源性代謝產物,CR需通過腎臟排出體外,當腎臟功能損傷,血液中CR含量升高,因此血液CR含量通常作為評判腎臟正常生理功能的重要指標[26-27]。TP、ALB含量均能夠反映肝臟正常生理功能。ALB是維持血漿滲透壓的重要物質,在血液中與有機物或無機離子結合,幫助其在血液中的運輸;同時,ALB可以與重金屬離子結合,消除重金屬離子對機體的毒害作用;通過TP、ALB指標綜合判斷,肝臟蛋白質合成的生理功能正常。

AST、ALT主要存在于心肌及肝臟細胞中,當肝細胞發生損傷時,血液中AST、ALT活性會顯著升高[28]。本試驗中,采食沙蔥乙醇提取物的奶牛血漿ALT、AST活性在數值上有一定程度的降低,這可能與沙蔥乙醇提取物調節體能量代謝有關。有研究表明,處于能量負平衡狀態下奶牛脂動員加強,產生大量非酯化脂肪酸,使肝臟中產生大量MDA和活性氧(ROS),誘導絲裂原活化蛋白激酶-p53/核因子E2相關因子凋亡通路的過度激活,導致肝臟損傷[29]。沙蔥乙醇提取物調節肝臟脂代謝,減少氧化物質對肝臟的損傷,對奶牛的肝臟具有一定的保護作用。根據本試驗結果顯示,沙蔥乙醇提取物對奶牛機體糖代謝、骨骼代謝及肝臟、腎臟等正常生理功能無影響。

3.2 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿抗氧化指標的影響

奶牛在生產過程中受到多種應激因素影響,易產生過量ROS,當超過機體抗氧化系統清除能力時則產生氧化應激。過量的活性氧刺激機體代謝增強,發生脂質過氧化,并引起DNA、RNA、酶類、脂質等氧化,破壞細胞完整性,對機體造成損傷[30]。有研究發現,組織氧化自由基的產生量與耗氧量呈現正相關關系[31]。泌乳中期的奶牛處于牛奶合成的較大生理壓力條件下,伴隨著對能量和氧氣需求的增加,乳腺細胞有氧呼吸作用增強導致產生大量ROS[32]。體內ROS大量積累致使抗氧化酶產生減少,內源性抗氧化物減少,影響正常生理功能,從而可能導致奶牛的氧化應激[33]。此外,ROS過多的積累會對機體免疫系統造成損傷,降低機體免疫力及生產性能。有研究發現,ROS不斷積累會激活氧化還原敏感信號轉導途徑,誘導促炎因子基因的表達,從而啟動炎癥反應。而且進一步造成免疫細胞氧化損傷,降低機體免疫力[34]。

機體內存在抗氧化酶系統與抗氧化非酶系統共同作用,增強機體抗氧化能力[35-37]。目前增強機體抗氧化能力的方式主要通過提高抗氧化酶活性以及提高機體內抗氧化非酶物質含量,來提高機體抗氧化能力。本試驗中,采食沙蔥乙醇提取物的奶牛血漿GSH-Px、SOD活性升高,血漿MDA含量降低,這可能與由于沙蔥乙醇提取物中含有多種抗氧化物質有關。部分黃酮類物質通過激活核因子E2相關因子2(Nrf2)-抗氧化反應元件(ARE)信號通路,促進內源性抗氧化酶的表達,增強機體抗氧化能力[38]。同時沙蔥乙醇提取物可能改變牛瘤胃微生物菌群結構,促進碳水化合物發酵產生乙酸、丙酸等有機酸,降低能量負平衡。有研究表明,部分有機酸類化合物能夠參與三羧酸循環供能,降低機體脂動員,減少機體MDA的產生[39]。李澤青等[40]研究復合有機酸能夠提高仔豬血清SOD和GSH-Px活性,同時降低血清MDA含量,提高仔豬抗氧化能力。肖凡[41]將大豆異黃酮飼喂荷斯坦奶牛犢牛后,發現血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC均顯著升高,且血清MDA含量降低。Ding等[42]將沙蔥粉飼飼喂杜寒羊后,發現血清GSH-Px、SOD活性及T-AOC均顯著升高,血清MDA含量顯著降低。同時,徐珊珊等[7]在對沙蔥精油對羊的抗氧化研究中也有相同發現。

3.3 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿免疫指標的影響

免疫球蛋白與抗原的特異性結合致使抗原失去致病能力,在體液免疫過程中發揮重要作用。IgG是血液中含量最高的免疫球蛋白,在體液免疫中發揮主要作用。免疫球蛋白含量的升高表明機體對病原體的抵抗能力增強。木其爾等[43]在探究沙蔥黃酮對肉羊免疫能力的研究中也得到沙蔥提取物可以顯著提高血清IgG含量,從而得出沙蔥黃酮具有調節肉羊免疫功能的結論。同樣,在沙棘黃酮對肉羊免疫功能的研究中也得到相似結論[44]。IL-2是一種重要的免疫應答調控因子,具有促進B細胞與T細胞的增殖活化,同時能溶解遭受病毒感染的細胞。IL-6由單核巨噬細胞、輔助性T細胞(Th細胞)、血管內皮細胞等細胞產生,屬于B細胞分化因子,是一種多功能細胞因子,可調節免疫反應、造血、急性期反應和炎癥,可增進淋巴細胞的增殖,激活殺傷性T淋巴細胞和參與炎癥反應,因此IL-6是一種促炎癥細胞因子[45]。有研究表明,IL-6由巨噬細胞受到刺激后,激活核因子-κB(NF-κB)信號通路而被大量釋放[46]。本試驗中,沙蔥乙醇提取物通過提高奶牛血漿中抗炎因子IL-2、IL-10含量,降低促炎因子IL-6含量,對奶牛的免疫功能具有調節作用。這可能是由于沙蔥乙醇提取物中含有黃酮類物質,可抑制NF-κB信號通路,降低促炎因子IL-6的mRNA表達,同時調節抗炎因子的mRNA表達,從而提高機體抗炎能力。

王特日格樂[47]研究發現,沙蔥總黃酮能夠抑制脂多糖(LPS)誘導的小鼠腹腔巨噬細胞NF-κB信號通路,從而降低促炎因子TNF-α、IL-6、白細胞介素-1β(IL-1β)及炎癥介質誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)、環氧化酶-2(COX-2)的mRNA表達,同時能提高IL-10的mRNA表達,達到降低炎癥的效果。Vizzotto等[48]研究發現,綠茶提取物中含有兒茶素、表兒茶素等多種黃酮類物質,能夠提高奶牛血液中IgG及抗炎因子含量,降低促炎因子含量,提高奶牛免疫力及抗炎能力。王翠芳[49]采用灌胃方式給與小鼠沙蔥提取物,檢測相關炎癥因子后發現,沙蔥提取物能夠顯著抑制IL-6的分泌,并顯著提高血液中IL-10含量,其結果與本試驗的結果一致。

3.4 沙蔥乙醇提取物對奶牛血漿激素指標的影響

前人研究發現,植物源黃酮的化學結構與動物機體雌激素的結構相似,能與機體雌激素受體結合從而發揮雌激素的生物學功能,并能夠顯著影響機體激素的分泌[50]。黃酮類化合物是沙蔥乙醇提取物的主要成分之一[51]。機體的生長發育需要多種激素的共同作用,其中GH促進組織生長發育,PRL、E2能夠促進乳房的發育及促進乳腺的泌乳[52-53]。研究發現,大豆異黃酮通過促進雌激素受體α的表達,促進乳合成和乳腺上皮細胞的增殖[54]。本試驗結果表明,沙蔥乙醇提取物對泌乳中期奶牛激素指標并無顯著影響。官麗輝等[55]在壩上長尾雞飼糧中添加大豆異黃酮后發現雌激素含量呈現先升高后降低趨勢,并未受到顯著影響,這與本試驗結果類似,其原因可能是異黃酮具有雌激素生物活性,高劑量黃酮類化合物與機體內源性雌激素爭奪受體,導致雌激素分泌減少[56]。有報道指出,當飼糧營養水平降低時會促進動物生長素釋放肽O-?；D移酶的表達,從而促進GH、INS等激素的分泌[57],而胰島素的分泌受到GLU含量的調控,本試驗結果中血漿GLU含量相對穩定,這可能是INS含量沒有顯著變化的原因。

4 結 論

飼糧中添加54 g/d沙蔥乙醇提取物能增強泌乳中期奶牛的免疫、抗氧化能力,且對奶牛血漿生化指標無不良影響。