飼糧非植酸磷水平對14日齡仔鵝腸道組織形態、食糜酶活性及菌群結構的影響

黃春慧 李 寧 胥 蕾 正旭城 楊海明 王志躍

(揚州大學動物科學與技術學院,揚州 225009)

磷是動物體內的必需礦物元素,參與動物機體的生長發育及生命活動,維持了動物機體正常的生理功能。Heyer等[1]研究發現,磷具有支持免疫系統和維持腸道組織結構的功能。有研究表明,飼料中含有適宜的磷可以顯著提高魚類腸道長度和重量[2-3]。黃學琴[4]認為降低肉鴨飼糧的營養和非植酸磷(NPP)水平,可降低肉鴨腸道的絨毛長度和隱窩深度。根據以上報道可知,NPP對于動物腸道生長具有重要作用。家禽飼糧中的磷大多以植酸磷的形式存在[5],但家禽體內不產生植酸酶,對植酸磷的利用率較低[6],因此應在家禽飼糧中添加NPP。微生物的各種代謝過程都需要磷的參與[7],家禽腸道內存在大量的微生物,影響家禽的健康及生產性能[8]。腸道微生物在家禽營養吸收、飼料消化能力和免疫反應等方面起到了十分重要的作用[9]。Mann等[10]研究發現,飼糧中鈣、磷含量增加,可促進斷奶仔豬胃內乳酸桿菌相對豐度增加14.9%。Borda-Molina等[11]研究發現,在飼糧中添加鈣、磷和植酸酶后,顯著影響肉雞腸道中微生物的定植。有研究報道,不同的鈣、磷添加量對肉雞腸道內的菌群構成和豐度產生影響[12]。目前,飼糧NPP水平與仔鵝腸道微生物間的相互作用研究甚少。本團隊的前期研究表明,飼糧NPP水平顯著影響仔鵝生長性能,低磷組14日齡仔鵝體重、平均日增重和平均日采食量都低于對照組和高磷組[13],但其作用機制尚未明確。在此基礎上,本研究擬從仔鵝腸道形態、食糜酶活性及菌群結構等方面探究飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝仔鵝消化功能的影響及飼糧NPP水平影響仔鵝生長性能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗采用單因素試驗設計。本試驗選用216只1日齡體重相近、身體健康的江南白鵝公鵝作為試驗動物。試驗全期試驗鵝自由采食、飲水,自然光照并按常規免疫程序進行免疫,保持圈舍衛生及通風良好。將試驗動物分為3組,每組6個重復,每個重復12只鵝。3個組的飼糧NPP水平分別為0.08%(低磷組,LP組)、0.38%(對照組,CP組)、0.78%(高磷組,HP組)。試驗期為14 d。

1.2 試驗飼糧

采用玉米-豆粕型飼糧作為基礎飼糧,飼糧組成參照Li等[10]。主要原料包括:玉米、豆粕、小麥麩、稻殼等。LP組、CP組和HP組飼糧營養水平:代謝能均為11.24 MJ/kg;粗蛋白質水平分別為18.29%、18.37%和18.44%;粗纖維水平均為4.27%;鈣水平分別為0.76%、0.78%和0.78%;總磷水平分別為0.35%、0.67%和1.05%;NPP水平分別為0.07%、0.39%和0.77%(實測值)。

1.3 測定指標

1.3.1 腸道指數

試驗第14天,每個重復選取1只體重相近的試驗鵝進行屠宰。屠宰后,將腸道取出并分離,分別測量十二指腸、空腸和回腸長度。去除腸道表面脂肪以及腸道內的食糜,稱量各腸段重量。

腸道相對長度(cm/g)=腸道絕對長度(cm)/體重(g);腸道相對重量(g/g)=腸道絕對重量(g)/體重(g)。

1.3.2 腸道組織結構

試驗第14天,每個重復選取1只體重相近的試驗鵝進行屠宰解剖。將腸道表面脂肪清理干凈,分別取十二指腸近端5 cm處、空腸和回腸中段約1 cm的腸段,用生理鹽水沖洗腸道內容物后將各腸段放入4%甲醛固定液中保存,具體操作過程參考劉慧軍等[14]。切片制作完成后觀察并測量腸道絨毛長度、隱窩深度和肌層厚度。

1.3.3 食糜酶活性

試驗第14天,每個重復選取1只體重相近的試驗鵝進行屠宰解剖。分別取14日齡仔鵝的十二指腸、空腸黏膜作為試驗樣本,測定其堿性磷酸酶和Na+-K+ATP酶的活性。測定所采用的試劑盒均購自南京建成生物工程研究所,測定步驟參照相應試劑盒說明書。

1.3.4 16S rRNA基因的高通量測序與分析

由于磷主要是在空腸中進行吸收轉運,與空腸中的微生物有最直接的接觸,故而本研究選擇對空腸內容物進行16S rRNA基因的高通量測序。去除空腸表面的脂肪,取2 cm左右空腸內容物作為試驗樣本。將試驗樣本放入EP管,-80 ℃保存。用于分析空腸內容物菌群組成及結構。樣本送至上海派森諾生物科技股份有限公司進行高通量測序分析。測序區域名稱:16SV3V(a),目標片段長度:480 bp。分析流程:首先對高通量測序的原始下機數據根據序列質量進行初步篩查;對于問題樣本重測、補測。通過質量初篩的原始序列按照index和Barcode信息,進行文庫和樣本劃分,并去除barcode序列。按照QIIME2 dada2分析流程進行序列去噪。對不同組的樣本在不同物種分類學水平的具體組成進行展示。

1.4 數據處理

采用SPSS 18.0軟件對數據進行單因素方差分析,當方差分析結果顯著時,采用Duncan氏法進行多重比較。數據結果用平均值和均值標準誤(SEM)表示,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 飼糧NPP水平對仔鵝腸道形態的影響

2.1.1 對仔鵝腸道指數的影響

1.2.2 實驗分組 將大鼠按照隨機數字法分為非糖尿病組(22只)和糖尿病組(22只),其中非糖尿病組大鼠采用隨機字母法分為ZT23亞組(11只)、ZT11亞組(11只)；糖尿病組大鼠分為ZT23亞組(11只)、ZT11亞組(11只)。所有大鼠在制備模型中飼養4周，隨后分別在ZT23和ZT11時間點，用戊巴比妥麻醉后，迅速打開胸腔，取出心臟。取材時間點設計參照文獻[6-10]。

如表1所示,LP組十二指腸、空腸和回腸的絕對長度顯著低于CP組和HP組 (P<0.05);LP組腸道相對長度均顯著高于CP組和HP組(P<0.05);LP組腸道的絕對重量顯著低于CP組和HP組(P<0.05),CP組回腸絕對重量顯著高于其他組(P<0.05);HP組空腸和回腸的相對重量顯著低于LP組和CP組(P<0.05)。

表1 飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝腸道指數的影響

2.1.2 對仔鵝腸道組織結構的影響

如表2所示,飼糧中添加NPP對14日齡江南白鵝的腸道組織結構并無顯著影響(P>0.05),各腸段之間腸道的絨毛長度、隱窩深度、肌層厚度和絨隱比并無顯著差異(P>0.05)。

表2 飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝腸道組織結構的影響

2.2 飼糧NPP水平對仔鵝腸道堿性磷酸酶和Na+-K+ ATP酶活性的影響

如表3所示,LP組十二指腸堿性磷酸酶活性顯著低于HP組(P<0.05)。LP組回腸Na+-K+ATP酶的活性顯著低于CP組和HP組(P<0.05)。

表3 飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝腸道堿性磷酸酶和Na+-K+ ATP酶活性的影響

2.3 飼糧NPP水平對仔鵝空腸微生物多樣性的影響

2.3.1 序列數及操作分類單元(OTU)數量統計

本試驗對所有樣本的有效序列,以97%的一致性進行OTU聚類,然后對OTU的序列進行物種注釋。如圖1所示,樣品共檢測出20 511個OTU,其中重復的OTU有3 531個,LP組有6 370個特有OTU,CP組有9 433個特有OTU,HP組有10 448個特有OTU。如圖2所示,隨著OTU數目的增大,所有組的曲線都趨于平緩,說明測序深度的增加不再影響菌種的鑒定,測序量合理。

LP、CP、HP分別表示低磷組、對照組、高磷組。下圖同。

橫坐標為序列數量,縱坐標為觀察到的物種數量。

2.3.2 Alpha多樣性分析

表4 飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝空腸微生物Alpha多樣性指數的影響

2.3.3 Beta多樣性分析

為了充分說明添加不同水平的NPP對14日齡江南白鵝空腸菌群的差異,本試驗進行了Beta多樣性分析,分析物種的系統發育關系和相對豐度。如圖3所示,在加權Unifrac距離和非加權Unifrac距離的基礎上進行主坐標分析(PCoA)。在非加權Unifrac主坐標分析中,第1個主成分(PCo1)解釋了樣本間19.8%的變化,第2個主成分(PCo2)解釋了樣本間8.8%的變化。而在加權Unifrac主坐標分子中,PCo1解釋了樣本間64.8%的變化,PCo2解釋了樣本間14.9%的變化。加權Unifrac距離不僅考慮了微生物菌群成員之間的系統發育,同時還考慮了微生物在各自的菌群中相對豐度的高低。從加權Unifrac中可以看出,LP組與其他2組相比物種變異較為明顯。根據非加權Unifrac可知,CP組和HP組的物種比LP組更為豐富。

A:非加權Unifrac PCoA unweighted Unifrac PCoA;B:加權Unifrac PCoA weighted Unifrac PCoA。

2.3.4 屬水平下的物種聚類分析

本試驗在屬水平下對微生物進行了物種聚類分析,如表5所示,LP組的代爾夫特菌屬(Delftia)、蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)、不動桿菌屬(Acinetobacter)和黃桿菌屬(Flavobacterium)相對豐度顯著高于CP組和HP組(P<0.05)。同時,LP組中KD1-23、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、囊裸藻屬(Trachelomonas)和紅育菌屬(Rhodoferax)的相對豐度顯著低于CP組和HP組(P<0.05)。

表5 飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝空腸微生物屬水平下前10菌群分布的影響

2.3.5 門水平下的物種聚類分析

本試驗在門水平下對微生物進行了物種聚類分析,如表6所示,變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和TM7為優勢菌群。LP組的擬桿菌門、綠菌門(Chlorobi)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度顯著低于CP組和HP組(P<0.05)。同時,LP組中TM7、厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度顯著高于CP組和HP組(P<0.05)。這說明飼糧NPP水平會改變仔鵝空腸的菌群結構。

表6 飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝空腸微生物門水平下前10菌群分布的影響

3 討 論

3.1 飼糧NPP水平對仔鵝腸道發育的影響

腸道是家禽消化、吸收營養物質的重要場所,因此,家禽腸道的健康發育對家禽機體健康和生產性能十分重要[15]。同樣,溫靜[3]的研究結果表明,適宜的磷水平可以提高草魚的腸道長度和腸道重量。本試驗結果表明,隨著飼糧NPP水平的升高,仔鵝的腸道絕對長度隨之增加;仔鵝的十二指腸和空腸絕對重量也隨著飼糧NPP水平的升高而增加。

腸道內的絨毛長度、隱窩深度和絨隱比是反映腸道吸收能力的重要指標[16]。Hou等[17]報道,腸絨毛長度和隱窩深度與腸道吸收能力密切相關。因此,隱窩深度越淺、絨毛長度越長,腸道吸收能力越好。絨毛長度縮短、營養吸收面積減少,會影響動物對營養物質的吸收能力;隱窩深度加深則表示組織細胞更新速度較快,促進絨毛發育[18]。Xu等[19]的研究表明,飼糧中NPP水平對14日齡肉鴨十二指腸肌層厚度呈線性影響。本試驗結果顯示,飼糧NPP水平對14日齡仔鵝腸道的絨毛長度、隱窩深度和腸層厚度沒有顯著影響。

3.2 飼糧NPP水平對仔鵝腸道堿性磷酸酶和Na+-K+ ATP酶活性的影響

腸黏膜是動物機體抵御外界病原侵襲、維持腸道健康的重要屏障結構[20]。Goldberg等[21]認為,腸道堿性磷酸酶在維持腸黏膜完整和改善腸道功能上具有一定的作用。腸道堿性磷酸酶能夠反映腸道發育情況以及小腸上皮細胞的吸收功能,能夠減少腸道炎癥的發生[22]。有研究發現,腸道堿性磷酸酶主要在十二指腸表達[23],在空腸和回腸的表達較低[24]。在本試驗條件下,CP組和HP組十二指腸中堿性磷酸酶活性高于LP組。這說明飼糧中足量的NPP水平可促進腸道堿性磷酸酶的分泌,減少腸道炎癥的發生,改善14日齡江南白鵝仔鵝的腸道功能。

Na+-K+ATP酶又被稱為鈉鉀泵,在維持細胞結構和細胞膜功能等方面有著十分重要的作用[25]。Na+-K+ATP酶可以通過催化ATP水解供能,調節細胞滲透壓,為營養物質的吸收提供動力。ATP是細胞內的一種高能磷酸化合物,含有2個高能磷酸鍵,因此磷是合成ATP的重要組成成分。Na+-K+ATP酶活性的高低,可以反映出腸道對營養物質吸收能力的強弱[26]。在本試驗中,隨著飼糧NPP水平的增加,CP組和HP組空腸中Na+-K+ATP酶的活性顯著高于LP組,飼糧NPP水平對14日齡仔鵝十二指腸中Na+-K+ATP酶的活性沒有顯著影響。

因此,飼糧中含有足量的NPP可能通過促進堿性磷酸酶和Na+-K+ATP酶的活性,增加小腸營養物質吸收的能量供應和上皮細胞結構的完整度,可提高腸道對營養物質的吸收能力。

3.3 飼糧NPP水平對仔鵝空腸菌群結構的影響

腸道正常生理功能的維持,離不開腸道微生物。腸道微生物結構的改變,對腸道健康有正面影響也有負面影響[27]。有研究表明,磷對于細菌的生長和增殖十分重要,并參與細菌的代謝過程[28]。在本試驗條件下,飼糧NPP水平對14日齡江南白鵝仔鵝空腸微生物的Alpha指數有顯著影響。LP組的表征群落內物種分布的多樣性和均勻度低于CP組和HP組。由此可以看出,低磷飼糧降低了Chao1指數、Observed species指數、Shannon指數和Simpson指數,影響腸道微生物物種的豐度以及多樣性。

代爾夫特菌屬、蒼白桿菌屬、不動桿菌屬和黃桿菌屬廣泛分布于自然界,這些細菌都屬于條件性致病菌[29-32]。有研究表明,代爾夫特菌屬主要出現在免疫力低下、患有嚴重基礎病的患者中[33]。蒼白桿菌屬擁有5個種,包括人蒼白桿菌、中間蒼白桿菌、假中間蒼白桿菌、嗜血蒼白桿菌和特瑞特西蒼白桿菌[34]。人蒼白桿菌可以引起蒼白桿菌的感染,而人蒼白桿菌具有致病性,不僅感染人類也可以感染動物[30]。Franci等[35]研究發現,由于手術的麻醉藥被人蒼白桿菌污染,從而導致健康犬在犬牙清垢手術后出現致命性休克。不動桿菌屬易生長,可以大量繁殖,從而破壞動物機體內微生態平衡,導致免疫力下降[36]。黃桿菌屬不僅存在于自然界中,還廣泛存在于動物腸道或器官中[37-38]。在本試驗中,LP組的致病菌代爾夫特菌屬、蒼白桿菌屬、不動桿菌屬和黃桿菌屬相對豐度顯著高于CP組和HP組。由此可以推測,低磷飼糧可能會降低仔鵝的免疫力、破壞微生態平衡,使仔鵝感染致病菌,從而導致仔鵝生產性能降低。KD1-23、硝化螺旋菌屬、囊裸藻屬和紅育菌屬多在水和土壤中分布。在本試驗中,LP組的KD1-23、硝化螺旋菌屬、囊裸藻屬和紅育菌屬的相對豐度顯著低于CP組和HP組。但這些細菌在仔鵝中的作用機制尚未明確,還需進一步的研究。

不同的微生物菌群組成對宿主體內平衡和正常代謝有重要影響[39]。變形菌門是細菌中最大的一個群體[40],也是腸道菌群中生態失調的標志物,Shin等[41]認為,變形菌門在腸道中大量出現可以反映出腸道微生物群落結構不穩定。在本試驗中,變形菌門在各組中處于重要地位,而飼糧NPP水平并未影響變形菌門的相對豐度,較為穩定。多糖是擬桿菌門的主要能量來源,它們可利用多種膳食可溶性多糖,代謝產物主要是乙酸鹽和丙酸鹽[42],在微生物消化和營養吸收等方面有著十分重要的作用。賈慧君[43]在肉雞上研究發現,飼糧中NPP水平在0.39%與0.45%組的擬桿菌豐度最大,且生產性能最佳。由此可以推測,擬桿菌門豐度升高可促進肉雞的生長發育。糖桿菌門又被稱為解糖微小寄生菌[44],是需要寄生在宿主細菌上生長的細菌[45],在土壤、海水、動物和人體的口腔、胃腸道等均有分布[46-49]。有研究表明,糖桿菌門對宿主細胞具有選擇性,目前糖桿菌門的宿主細菌主要是放線菌屬,一小部分為假丙酸桿菌屬[50-51]。糖桿菌門對于宿主細菌的有利之處在于可以使宿主細菌更好的定植,增加定植部位的菌量[52];而其對宿主細菌的負面影響在于會導致宿主細胞生長和增殖過于緩慢,甚至死亡[45]。本試驗中,LP組糖桿菌門相對豐度高于其他2組,而與之相關的宿主細菌放線菌門的相對豐度在各組之間并無顯著差異。但LP組的放線菌門的相對豐度比其他2組低20%,因此推測,糖桿菌門對放線菌產生負面影響。厚壁菌門是腸道中最主要的菌群之一,也是最豐富的門之一[53]。厚壁菌門與擬桿菌門都是腸道內最主要的細菌,兩者之間存在相互促進的共生關系,因此,2種細菌之間的比例也十分重要。本試驗中,LP組的有害菌厚壁菌門相對豐度顯著高于CP組和HP組。同時,LP組的厚壁菌門相對豐度升高,擬桿菌門相對豐度降低,可以看出飼糧NPP水平過低會增加有害菌比例,降低有益菌比例。這可能是導致仔鵝對生產性能降低的原因之一。

4 結 論

仔鵝飼糧NPP水平過低可代償性地增加腸道相對長度,但其造成的腸道功能性酶活性下降、空腸微生物菌群失衡可能是飼糧低磷水平導致仔鵝生長性能下降的重要原因。鵝可耐受高達0.80%的NPP且對仔鵝早期腸道發育、空腸微生物結構無不利影響。