骨骼肌源外泌體在肌肉和脂肪組織發育中的研究進展

李奇隆 陳思思 郭秋平 李鳳娜*

(1.中國科學院亞熱帶農業生態研究所亞熱帶農業生態過程重點實驗室,動物營養生理與代謝過程湖南省重點實驗室,長沙 410125;2.中國科學院大學現代農業科學學院,北京 100049)

骨骼肌是由近軸中胚層一側的肌原細胞發育而來,成肌祖細胞經過終末分化形成單核成肌細胞,然后融合成肌管,最終生成具有生物功能的肌肉組織[1]。骨骼肌約占人體的40%,負責全身能量穩態并作為身體蛋白質池,是一個高度動態和可塑性的器官,可響應運動和代謝需求。外泌體是具有脂質雙層膜結構且直徑為30～150 nm細胞外囊泡的一種亞群,能被骨骼肌細胞分泌。近幾年的研究發現,骨骼肌源外泌體中含有細胞特異性的核酸、蛋白質、脂質和其他代謝產物,能作為信號分子傳遞給骨骼肌細胞或脂肪細胞,從而調控這些細胞的相關功能,在肌肉和脂肪組織發育過程中扮演著重要角色[2-3]。本文首先概述了外泌體的生成和組成,之后分別闡述了骨骼肌源外泌體在肌肉和脂肪組織發育過程中的調節機制,最后列舉了工程化外泌體在骨骼肌中的具體應用。

1 外泌體概述

1.1 外泌體的生成

在生物體正常生理及病理狀態下,各組織器官都能合成并分泌細胞外囊泡,根據它們的生物發生模式、組成和大小,細胞外囊泡的3個主要亞群被識別出來:外泌體、微粒和凋亡小體[4]。外泌體是在1983年研究網織紅細胞成熟為紅細胞過程中產生轉鐵蛋白時被發現的[5],是一種直徑大小范圍在30～150 nm(平均100 nm)的具有內體來源的細胞外囊泡[6]。外泌體的產生涉及一個獨特的細胞內調節過程,這決定它們的組成,并且一旦分泌到細胞外空間,可決定它們的功能[7-8]。質膜先是第一次內陷,后依次形成含有腔內囊泡的早期分選核內體、晚期分選核內體,最終形成細胞內多囊泡體(multivesicular bodies,MVBs),當MVBs與質膜融合時,釋放外泌體[9-11](圖1)。

TSG101:腫瘤易感基因101 tumor susceptibility gene 101;Alix:凋亡連接因子2-相互作用蛋白X apoptotic linking factor 2-interactingprotein X。

1.2 骨骼肌源外泌體的組成

骨骼肌源外泌體富含核酸、蛋白質和脂質,參與全身代謝。已有研究報道,來自不同細胞類型的外泌體樣囊泡(exosome-like vehicles,ELVs)制劑已證明它們含有不同的RNA群體,這其中包括轉錄本[12-13]和非編碼RNA[14]。在骨骼肌細胞中,C2C12細胞源ELVs也富集miRNA亞群[15]。通過對成肌細胞ELVs中最集中的miRNA進行生物信息學預測,表明其可共同調節肌肉生理學的重要細胞通路,即參與肌肉質量調節的信號通路、神經肌肉接頭、免疫反應、鈣信號和細胞骨架的信號通路[15]。同時利用DNA微陣列技術,在人類骨骼肌細胞釋放的ELVs也檢測到了mRNA,185個轉錄本被鑒定,并且ELVs顯著富集編碼受體和離子通道的轉錄本,以及轉錄調節因子,特別是鋅指轉錄因子[16]。此外,蛋白質組學分析已經確定了從人體肌管的條件培養基中釋放的ELVs特定蛋白質亞群,在“膜泡運輸”、“細胞黏附與遷移”、“自由基清除”和“細胞間信號轉導與相互作用”的蛋白中富集[17];同時比較蛋白質組學分析也表明,肌管ELVs蛋白主要是那些被內吞并進入內體以嵌入MVBs或降解進入溶酶體的蛋白[18-19]。

細胞內脂肪酸的積累會使葡萄糖代謝受到抑制,產生胰島素抵抗,ELVs的釋放則可能是保護細胞的形式之一,以防止細胞內脂肪酸的積累[20]。脂質也是ELVs膜的重要組成部分,特定脂質在ELVs中富集[21]且這種特異性脂質富集、膜高蛋白質脂肪比和不對稱分布與較高的膜硬度有關[22];與其他脂肪酸相比,肌管ELVs富集棕櫚酸、硬脂酸、油酸、棕櫚油酸和月桂酸,這些脂肪酸被用于產生能量或用于組成細胞膜的磷脂雙分子層[21,23]。

2 骨骼肌源外泌體在肌肉發育中的作用

多項研究表明,骨骼肌源外泌體在維持肌肉穩態和與其他組織交流方面具有旁分泌和內分泌雙重作用[24-25],成肌細胞和肌管這2種肌細胞類型是表達四跨膜蛋白家族、腫瘤易感基因101(TSG101)和凋亡連接因子2-相互作用蛋白X(Alix)等蛋白標記物以及參與信號轉導的其他蛋白[20,26-27]的外泌體來源,其釋放的外泌體可將其蛋白、mRNA和miRNA轉運到受體細胞,從而調節靶細胞功能[28-29],扮演著細胞與細胞之間相互交流的角色,介導組織間通訊[30]。骨骼肌源性外泌體在成肌細胞的增殖、分化和肌肉損傷修復中發揮著重要作用(圖2)。

ELVs-MT:肌管源外泌體樣囊泡 exosome-like vehicles derived from myotubes;TNF:腫瘤壞死因子 tumor necrosis factor;DIO:膳食誘導肥胖 diet-induced obese;MyoG:肌細胞生成素 myogenin;MyoD1:成肌分化因子1 myogenic differentiation 1;Cyclin D1:細胞周期蛋白D1;Akt:蛋白激酶B protein kinase B;Sirt1:沉默信息調節因子2同源蛋白1 silent mating type information regulation 2 homolog 1;MHC:肌球蛋白重鏈 myosin heavy chain;PCNA:增殖細胞核抗原 proliferating cell nuclear antigen;CKMT2:線粒體肌酸激酶2 creatine kinase, mitochondrial 2。

2.1 成肌細胞增殖

生物信息學分析發現,成肌細胞源外泌體樣囊泡(exosome-like vehicles derived from myoblast,ELVs-MB)和肌管源外泌體樣囊泡(exosome-like vehicles derived from myotubes,ELVs-MT)差異表達miRNA的預測靶基因參與肌肉生長發育過程[26],尤其可能參與在成肌過程中被調控的經典Wnt信號通路[34]。成肌細胞產生的ELVs可能反映了細胞增殖過程中發生的蛋白質、核酸或脂質周轉[27,35]。研究報道,用棕櫚酸酯培養后的C2C12細胞源外泌體能夠降低成肌細胞中基因肌細胞生成素(MyoG)和成肌分化因子1(MyoD1)的表達,提高細胞周期蛋白(cyclin)D1和蛋白激酶B(Akt)蛋白的表達水平,促進成肌細胞增殖[23];在輕微氧化應激狀態下,肌管細胞源外泌體可以下調成肌細胞基因MyoG和肌球蛋白重鏈(MHC)的表達,上調增殖細胞核抗原(PCNA)的表達,表明該狀態下可以促進成肌細胞增殖[32];此外,骨骼肌組織條件培養基得到的外泌體(含有ELVs-MT和ELV-MB)還可以通過調控骨骼肌干細胞微環境,顯著上調肌衛星細胞cyclinD1基因表達,下調成肌分化因子(MyoD)、MyoG基因表達而促進肌衛星細胞的增殖[36],但用C2C12細胞源,只含有ELVs-MT處理成肌細胞時,則得到了與上述相反的結果[26]。上述研究揭示了骨骼肌源外泌體在成肌細胞增殖過程中所發揮的作用并不一致,而產生上述差異的原因可能與成肌細胞分泌的外泌體是由不同的誘導環境所產生,從而導致異質性。

2.2 肌管的形成

已有研究報道,ELVs-MT的miRNA可靶向成肌細胞增殖相關基因沉默信息調節因子2同源蛋白1(Sirt1)的3′-非翻譯區(UTR),通過這一途徑降低成肌細胞中內源性Sirt1的表達水平,從而誘導細胞分化[31];ELVs-MT還會誘導成肌細胞表達分化早期標志蛋白如MyoG[26]。與此相反的是,膳食誘導肥胖(diet-induced obese,DIO)小鼠ELVs-MT中含有的棕櫚酸被轉移到受體肌管中,肌肉分化標志蛋白如MoyG、MyoD1和線粒體肌酸激酶2(creatine kinase, mitochondrial 2,CKMT2)等均被下調[23],表明富集棕櫚酸的ELVs-MT可抑制成肌細胞分化形成肌管,并最終影響肌肉組織表型;在病理狀態下骨骼肌源外泌體抑制成肌細胞分化,并誘導肌肉萎縮[33]。在成肌細胞分化的過程中分泌的外泌體可內化到脂肪組織中的干細胞,誘導其與鄰近細胞融合,產生表達MHC和結蛋白的肌管樣細胞[37]。研究報道,許多參與從成肌細胞到肌管形成的蛋白都在外泌體中被發現,推測外泌體在成肌細胞分化形成肌管的過程中發揮著重要作用;隨著成肌細胞分化形成肌管,分泌蛋白的模式也會隨之發生改變,蛋白質組學分析表明,大部分外泌體蛋白來源于骨骼肌細胞質,并且在這些蛋白中,只有10%具有典型的分泌序列,43%被鑒定為缺乏N端分泌序列的非經典分泌蛋白[16,38]。上述研究進一步表明,骨骼肌源外泌體對成肌細胞分化調控功能的差異與在不同生理狀態下分泌的外泌體成分有著緊密聯系。

2.3 肌肉損傷修復

已有研究報道,從發炎的肌管中分離出的ELVs能夠引起成肌細胞炎癥,誘導肌肉萎縮[33]。除炎癥模型外,肌管來源的外泌體可通過改善杜氏肌營養不良癥(Duchenne muscular dystrophy,DMD)小鼠的肌肉膜完整性來實現功能改善和緩解肌肉退化[39];同時還有研究進一步報道,窖蛋白-1是一種抗纖維化信號分子[40],DMD患者肌源性成纖維細胞外泌體miR-199a-5p靶向該分子,可誘導骨骼肌纖維化[41]。在肥大刺激的情況下,骨骼肌衛星細胞被激活,在位于纖維周圍的細胞外基質(extracellular matrix,ECM)中產生成肌祖細胞(myogenic progenitor cells,MPCs),MPCs分泌含有miR-206的ELVs,抑制纖維化受體細胞中膠原蛋白生物合成的主要調節因子核糖體結合蛋白1[42],進而防止過度的ECM沉積,以適應肥大刺激下的最佳肌肉重塑。上述研究表明,骨骼肌源外泌體與肌肉萎縮有關,揭示了骨骼肌源外泌體對DMD或其他膜受損的骨骼肌疾病的治療潛力。

在肌肉萎縮的情況下,用地塞米松處理C2C12肌管48 h降低了細胞內miR-23a的水平,但增加了其在ELVs-MT的豐度[43],表明萎縮誘導條件下導致miRNA選擇性裝載到ELVs-MT中。研究發現,過氧化氫(H2O2)預處理肌管釋放的ELVs與成肌細胞共孵育以模擬氧化應激,可導致肌管直徑減小,并刺激成肌細胞增殖[32];另有研究發現,用腫瘤壞死因子(TNF)-α和TNF-γ的混合物處理肌管時也觀察到類似結果[33]。根據上述研究推測,ELVs-MT可能影響成肌細胞的增殖與分化過程,從而參與損傷后骨骼肌質量維持和再生。

3 骨骼肌源外泌體在脂肪發育中的作用

骨骼肌源外泌體在體內多種組織的摻入,表明骨骼肌可通過外泌體途徑將特定的信號傳遞到關鍵代謝組織[23,44]。目前的研究中,肌肉釋放的外泌體對脂肪組織穩態的調節作用研究較少,且主要集中在骨骼肌源外泌體,而骨骼肌也能行使分泌功能對脂肪細胞產生調節作用[45-46]。研究發現,miR-146a-5p主要富集在骨骼肌來源的外泌體中,其通過遞送miR-146a-5p顯著抑制前體脂肪細胞的成脂分化[47],表明miR-146a-5p對于調節正常骨骼肌發育和脂肪生成之間的平衡至關重要;快慢骨骼肌特異性分泌的外泌體攜帶miR-27a-3p可抑制成纖維-成脂祖細胞(fibro-adipogenic progenitors,FAPs)成脂分化,減少甘油誘導的肌間脂肪浸潤[48];miR-133a和miR-206在肌纖維來源的外泌體中高表達,可下調其靶蛋白Smarcd1和侏儒相關轉錄因子2(Runx2)在前體脂肪細胞中的表達水平[49],這表明骨骼肌源外泌體中含有的miRNA可以轉移到前體脂肪細胞中調節基因表達。在健康情況下,骨骼肌源外泌體作為抵抗成脂信號,可抑制3T3-L1脂肪細胞中的脂質積累,并抑制FAPs分化為脂肪細胞。此外,肥大肌管來源釋放的外泌體樣囊泡可調節兒茶酚胺敏感性并誘導脂肪細胞釋放甘油[50],表明骨骼肌源外泌體樣囊泡可以局部控制脂肪組織的發育,并調節脂肪組織中代謝物的釋放來實現合適的骨骼肌能量代謝。上述研究揭示了骨骼肌源外泌體尤其是富集的miRNA對脂肪細胞分化發育命運的重要調控作用。

4 工程化外泌體在骨骼肌發育中的應用

外泌體廣泛參與骨骼肌的生理和病理過程,但是由于外泌體的純度較低和產量不足,需要大量的供體才能在體內誘導足夠的效應[51-52],而人工合成的外泌體具有組織特異性靶向修飾能力,其可能是體內研究的一種節省供體的優選方法。例如,miR-26a是骨骼肌分化和再生過程中所必需的[53],制備的包含肌肉特異性靶向肽的miR-26a過表達外泌體,有助于其選擇性遞送至肌細胞[54];還有研究將miR-215模擬物轉染到大鼠骨髓間充質干細胞中,開發了過表達miR-215的外泌體,逆轉了H2O2誘導的細胞活力抑制并增加了L6細胞的凋亡[55]。除了外泌體miRNA外,外泌體蛋白也有生物活性作用。據報道,含有熱休克蛋白60(heat shock protein 60,Hsp60)的外泌體可誘導過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活蛋白-α1(peroxisome proliferators-activated receptor γ coactivator-α1,PGC-1α)表達[56],則通過用Hsp60過表達質粒對C2C12細胞系進行基因修飾,產生了含有Hsp60的外泌體,激活了C2C12細胞系中直接參與線粒體生物合成和抑制肌肉萎縮的PGC-1α異構體1的表達[57]。此外,還有工程化外泌體作為誘導受體調節骨骼肌發育的報道,如有研究構建了表達白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)信號轉導子的誘導受體的外泌體,該誘導受體選擇性抑制C2C12成肌細胞和肌管中的IL-6反式信號通路,從而部分改善IL-6受體復合物的誘導效應[58]。總體而言,具有修飾內容物和組織特異性靶向能力的工程化外泌體在肌肉疾病的治療中展現出較好的應用前景。

5 小結與展望

綜上所述,骨骼肌源性外泌體在骨骼肌發育中的成肌細胞增殖、分化和損傷修復中的研究較為深入,而對于脂肪組織穩態的調控作用研究缺乏,骨骼肌源外泌體在脂肪組織的穩態中扮演的角色還需要進一步探究。細胞內吞、膜融合和受體介導的內化是外泌體被細胞內吸收的主要機制[59],這些可變的內化機制和外泌體中存在的信號分子是外泌體被廣泛接受為微環境中細胞間通訊的重要參與者并值得研究的重要原因[60]。肌肉與脂肪組織之間相互作用的研究主要集中在脂源性外泌體在肌肉穩態中的調節功能,兩者是否互作平衡值得深入探討,并且在肌源性外泌體方面只有骨骼肌源在組織互作中受到關注,不同類型肌纖維釋放的外泌體如何參與“對話”?它們在不同類型的脂肪組織中是否也以相同的方式調節脂肪細胞脂質代謝穩態?目前,體外研究已明確骨骼肌組織釋放的外泌體可控制脂肪組織中脂質生成,肌肉和脂肪組織之間通過交換多種信號來控制各自的質量和代謝穩態。此外,當前對外泌體的識別和其作用機制的了解還遠遠不夠,只有少數miRNA被鑒定出來,外泌體的脂質和蛋白質很可能在其生物學作用中發揮著重要作用。因此,系統探討不同誘導環境或生理狀態下骨骼肌源外泌體內容物的異質性及其對脂肪組織發育過程的調節機制,在肌肉與脂肪組織的互作平衡研究中顯得尤為重要。