植物單寧調控反芻動物溫室氣體排放的研究進展

王 瑩 李留學 趙玉超 蔣林樹

(北京農學院動物科學技術學院,奶牛營養學北京市重點實驗室,北京 102206)

溫室效應造成的全球氣候變化問題已經引起了國際社會的廣泛關注,溫室氣體的大量排放是加劇溫室效應的直接原因[1-2]。農業系統是溫室氣體排放的重要來源,約占排放總量的30%,其中畜牧業是農業溫室氣體排放的重要來源,占全球總人為排放量的14.5%[3-4]。二氧化碳(CO2)、甲烷(CH4)和氧化亞氮(N2O)是農業系統中動物產生的3種主要溫室氣體[5],除CO2這一最重要的溫室氣體之外,排放量占比相對較小的CH4和N2O也逐漸受到科學家的關注,其增溫潛勢分別是CO2的25倍和298倍[6]。CH4的產生也代表著反芻動物的能量損失,占總攝入能量的2%～12%[7],而反芻動物排泄物生成N2O的過程也造成了氮素的損失[8]。因此,有效抑制反芻動物生產中溫室氣體的生成,一方面有利于減少溫室氣體排放,減緩溫室效應;另一方面有利于減少飼料能量和蛋白質損失,提高飼料效率。

大量研究表明,植物次級代謝物可以調節瘤胃發酵,抑制CH4排放,而單寧廣泛存在于植物界中,是植物次級代謝物中的研究熱點[9-10]。同時,單寧在瘤胃中可與飼料蛋白質結合,減少其在瘤胃中的降解,提高反芻動物蛋白質利用率,從而降低N2O排放[11]。據此,本文對植物單寧調控反芻動物溫室氣體排放進行綜述,以期為進一步研究和開發植物單寧作為瘤胃CH4和排泄物N2O排放的抑制劑提供參考。

1 反芻動物溫室氣體的生成

1.1 瘤胃CH4的生成

反芻動物產生的CH4主要來自瘤胃發酵。瘤胃內CH4的產生與瘤胃內微生物的組成密切相關,主要的產甲烷菌屬有甲烷短桿菌屬(Methanobrevibacter)、甲烷微菌屬(Methanomicrobium)、甲烷球形菌屬(Methanosphaera)以及甲烷桿菌屬(Methanobacterium)等[12-13]。飼糧進入瘤胃后,碳水化合物在微生物厭氧發酵的作用下降解為揮發性脂肪酸(volatile fatty acids,VFA)、CO2和氫氣(H2)等代謝產物,CO2和H2在產甲烷菌的作用下生成CH4[14-15];同時,VFA中乙酸和丁酸的生成會釋放H2,H2分壓增加會抑制NADH脫氫酶的功能,進而影響瘤胃發酵,CH4的合成可以避免H2累積,是瘤胃代謝的必要過程,但此過程也造成了能量的損失[16];而丙酸的生成過程則可以利用H2,減少CH4生成[17](圖1)。關于瘤胃CH4調控的研究已有諸多報道。從調控機理上來看,一是減少H2生成量或調控H2代謝;二是抑制產甲烷菌的數量和活性[14]。此外,瘤胃CH4的生成還受原蟲的影響,產甲烷菌附著在原蟲的表面,并依靠原蟲體表的汁液生長,而原蟲表面的產甲烷菌則能將氫去除,從而有利于原蟲的生長。因而,原蟲的數量影響產甲烷菌的生長,從而影響瘤胃中CH4的產量[18]。Ma等[19]證實,桑葉黃酮提取物有效抑制了飼喂高粗料飼糧母羊瘤胃CH4生成,瘤胃產甲烷菌與原蟲數量的減少有助于減少CH4生成量。

H2:氫氣 hydrogen;CO2:二氧化碳 carbon dioxide;CH4:甲烷 methane:+:生成 production;-:消耗 consumption。

1.2 排泄物N2O的生成

銨離子 ammonium ion;NH3:氨氣 ammonia gas;NH2OH:羥胺 亞硝酸根離子 nitrite 硝酸根離子 nitrate ion;N2:氮氣 nitrogen gas;N2O:氧化亞氮 nitrous oxide;NO:氧化亞氮 nitric oxide;→:硝化 nitration;:反硝化 denitrification。

2 植物單寧概述

單寧又稱多酚或鞣質,是高分子質量的水溶性的多酚類化合物,廣泛分布于大多數植物的樹皮、木材、水果、葉子、花和根中[15]。植物中的單寧通常以水解單寧(hydrolyzed tannin,HT)和縮合單寧(condensed tannin,CT)2種形式存在[9](圖3)。HT是由若干沒食子酸或鞣花酸分子酯化形成的由多元醇(包括糖類和酚類)組成的核心分子;與HT不同的是,CT是由多個黃烷-3-醇(如兒茶素)或者沒食子兒茶素縮合而成,沒有多元醇核心[25]。長期以來,植物單寧被認為是抗營養因子,有降低動物采食量、影響營養物質消化等不利作用[26]。但近年來研究發現,飼糧中添加適量植物單寧在反芻動物過瘤胃蛋白保護、改善瘤胃發酵、提高飼料氮利用效率、提高生產性能、減少CH4排放和降低氮排放等方面具有一定的積極作用[27]。植物單寧在反芻動物生產中的應用效果,取決于單寧添加量、結構、植物來源以及動物種類、生理狀態和飼糧組成等因素。

圖3 水解單寧(a)和縮合單寧(b)的結構

3 植物單寧對反芻動物溫室氣體排放的調控作用

3.1 植物單寧對CH4生成的調控

3.1.1 體內試驗的相關研究

表1列出了不同植物來源的單寧在反芻動物體內抑制CH4排放的研究結果,可以看出目前研究多集中于CT,而對HT的研究相對較少,可能是因為HT被瘤胃微生物降解后對反芻動物有一定毒性[28]。雖然植物單寧被認為是抗營養因子,作為CH4抑制劑,可能會降低動物采食量和瘤胃內纖維消化率,但一些研究表明適量添加植物單寧并不會對反芻動物采食量和生產性能造成負面影響。Alves等[29]報道,在奶牛飼糧中添加120 g/d的金合歡單寧提取物顯著降低了CH4的產量,且不會對采食量和生產性能造成負面影響。同樣,Zhang等[30]的研究表明,在綿羊飼糧中添加30和60 g/kg DM的五倍子單寧提取物,CH4產量分別減少了37.6%和36.4%,且不影響生產性能和營養物質表觀消化率。

表1 植物單寧調控瘤胃CH4生成的體內試驗研究

單寧對瘤胃CH4生成的抑制作用存在著多重機制。一般認為,瘤胃CH4產量的線性降低可能與瘤胃部分產甲烷菌屬的生長或活性被單寧抑制有關。在羔羊飼糧中分別添加4%的CT和HT,產甲烷菌的豐度均有類似的下降,驗證了單寧對產甲烷菌的抑制作用[11]。此外,由于部分與氫轉運相關的細菌附著在原蟲表面,單寧還可以通過抑制瘤胃原蟲的數量,從而間接影響CH4的生成[31]。研究表明,瘤胃纖維消化與CH4產生之間存在相關聯系,單寧降低瘤胃CH4排放的作用通常是中性洗滌纖維(NDF)降解減少的結果,反過來又導致乙酸合成的減少,最終導致產甲烷菌的電子供體可用性降低,這可能是由于單寧的高分子質量和多酚性質使其與微生物酶或細胞壁形成復合物,從而導致對產甲烷菌和纖維素溶解的抑制[5,32-33]。De Oliveira等[34]比較了飼喂含有不同單寧的飼糧對山羊的影響,發現高單寧含量組瘤胃NDF降解率更低,推測單寧可以抑制瘤胃纖維降解。Tavendale等[35]指出,單寧對CH4生成的抑制作用,一是通過直接抑制產甲烷菌的數量,二是間接抑制飼料消化率,減少H2生成量來減少CH4產量。同樣,Salami等[11]也發現,單寧抑制了羔羊瘤胃中原蟲的豐度,并抑制了纖維桿菌和產甲烷菌的數量。由此可見,單寧可以通過直接抑制產甲烷菌的豐度和間接減少纖維消化來減少H2的產生,也可以通過調節原蟲種群,降低纖維降解率,進而降低瘤胃CH4產量。

但也有一些研究表明,反芻動物飼糧中添加單寧并未降低CH4的產量,且會降低營養物質消化率。Tavendale等[36]的研究表明,在肉牛飼糧中添加1.5% DM的HT或HT與CT混合物,與對照組相比,瘤胃CH4產量并無顯著下降。Beauchemin等[37]的研究表明,在肉牛飼糧中分別添加1%和2% DM的白堅木單寧提取物,瘤胃CH4產量并無顯著下降,而粗蛋白質消化率分別下降了5%和15%。此外,單寧的調控作用受到單寧添加量的影響。在山羊飼糧中分別添加2.8和5.6 g/kg DM的含羞草單寧,CH4產量均顯著降低,而高水平組的營養物質消化率則比對照組和低水平組低[38]。Min等[39]報道,飼糧中單寧添加量在2.2%～4.0% DM時,能夠有效降低CH4排放,且不影響綿羊的生產性能。薈萃分析結果顯示,隨著飼糧單寧含量的增加,反芻動物CH4排放量下降的幅度減小[40]。有關單寧抑制反芻動物瘤胃CH4排放的效果未來仍需要大量體內試驗進行篩選驗證,選出理想的單寧來源和添加量。

3.1.2 體外試驗的相關研究

體外產氣試驗是篩選潛在的CH4抑制劑普遍采用的方法。體外研究表明,單寧具有降低CH4產量的活性,一方面直接通過抑制產甲烷菌活性來降低CH4產量,另一方面間接通過瘤胃發酵(如VFA)或微生物群(如原蟲、厚壁菌門和擬桿菌門)變化來降低CH4產量[40-43]。表2總結了不同植物來源的單寧在體外試驗中對CH4生成抑制效應的研究結果。例如,用五倍子單寧提取物進行體外培養,會通過降低奶牛瘤胃液中總原蟲和總產甲烷菌的數量降低CH4產量[41]。盡管體外試驗得到了很多積極的CH4抑制效果,但不同植物來源的單寧在作用模式上存在明顯差別。Choi等[44]通過對5種紅海藻單寧提取物的體外培養發現,補充紅海藻提取物可以改變與丙酸生產相關的原蟲群落,導致丙酸生成加速,同時,產甲烷菌的相對豐度降低,CH4產量減少。Battelli等[45]觀察到在48 h的發酵過程中,白堅木單寧和栗子單寧都顯著減少了CH4的產生,而有關原蟲和產甲烷菌的數量并沒有顯著變化。體外研究的結果進一步表明產甲烷菌的豐度并不總是與CH4產量呈正相關,單寧對瘤胃發酵與瘤胃微生物的作用模式是多樣的,很難用一種機理去解釋。因此,需要針對不同植物來源單寧的結構特性,采用分子生物學手段,進一步研究不同飼糧下的CH4生成與產甲烷菌、原蟲和其他微生物的關系,從微生態角度理解植物單寧種類或結構影響CH4產生的機理。

表2 植物單寧調控瘤胃CH4生成的體外試驗研究

盡管體內研究往往難以重復單寧抑制體外瘤胃CH4排放的顯著效果,但體外試驗作為篩選有效的單寧的經典手段仍不容忽視。一方面,植物來源的單寧在抑制CH4效應上,受到植物營養成分、收獲期等影響。Gemeda等[46]用19種含單寧植物進行體外產氣試驗,發現植物中粗灰分、粗脂肪、非纖維性碳水化合物、粗蛋白質含量與CH4產量呈負相關;該研究還發現,沙拉地榆干草中單寧含量隨著成熟度的提高而減少,因此抑制CH4排放的能力也不同。另一方面,可以從單寧測定入手,來預測含單寧植物CH4抑制效應。Bhatta等[42]的結果表明,總單寧含量與產甲烷古菌數量呈負相關,而產甲烷古菌數量與CH4產量呈正相關。

雖然HT可能在動物體內引發毒性反應,但也有體外試驗表明HT抑制CH4排放的能力并不比CT差。Jayanegara等[43]指出,HT比CT具有更強的抑制CH4生成的效果,這可能與HT沉淀蛋白質能力較強有關,并且他們認為CT主要通過降低纖維消化率來減少CH4生成,而HT主要通過抑制產甲烷菌數量和活性來減少CH4生成,對飼糧消化率的影響更小。研究報道,單獨添加CT或與HT聯用,不同濃度的CT均可降低CH4的產量,且二者聯用降低效果大于單獨添加[47]。Bhatta等[42]通過體外產氣試驗發現,CT與HT聯用組的CH4產量明顯低于只添加HT組的CH4產量。因此,除了較為廣泛的CT外,也需要開展HT的研究或者2種單寧組合效應的研究,同時探索單寧添加量的“閾值”,并采取合適的方法降低單寧的毒性。動物的種類是影響單寧效果的因素之一,但往往被忽視。Bueno等[48]比較了來源于金合歡的CT對奶牛、肉牛、水牛、綿羊和山羊5種動物瘤胃液體外發酵CH4產量的影響,發現CT對體形較大的反芻動物的抑制效果要比體形小的更明顯。由此可見,單一物種的體外研究結果并不能直接套用到另一物種上,體外篩選單寧時,有必要建立多物種人工瘤胃發酵的體外篩選模式,進而在各種反芻動物中進行廣泛的體內試驗來反復驗證。

3.2 植物單寧對N2O生成的調控

表3 植物單寧調控反芻動物氮排泄與排泄物N2O生成的試驗研究

糞氮主要是有機氮,不易揮發;而尿氮主要成分為易降解的尿素,并通過硝化和反硝化生成N2O,占草牧系統N2O排放量的60%[57]。因此,可以考慮通過減少尿氮排泄來減少反芻動物N2O生成。單寧可以與蛋白質結合形成單寧-蛋白質復合物,減少蛋白質在瘤胃中的降解,使氨基酸在皺胃和后部消化道消化吸收,提高氮的利用率,從而改變氮排泄[58]。此外,糞便中的單寧-蛋白質復合物更能夠“抵抗”土壤的降解作用,因為含復合物的糞便的礦物質化作用受到抑制,且要比不含復合物的糞便分解速度更慢,由此可降低N2O生成[59]。

表3總結了單寧調控反芻動物氮排泄與N2O生成的研究結果。

Pathak等[49]研究發現,在羔羊飼糧中添加無花果單寧和番石榴單寧混合物顯著影響了氮的利用和氮沉積,與對照組相比,飼喂單寧組的氮沉積率顯著提高,且飼喂含CT飼糧的羔羊尿氮排泄量顯著降低,糞氮與尿氮的比值提高。同樣,在綿羊飼糧中添加板栗和含羞草單寧可以提高綿羊氮利用的潛力,減少了尿氮排泄并增加了糞氮的排泄[60]。Aboagye等[58]的研究表明,栗子單寧和單寧酸可將肉牛氮排泄從尿液轉移到糞便,且不會影響生產性能。同樣,白堅木和栗子單寧提取物混合物可以減少奶牛尿氮排泄,且不影響其產奶量[61]。由此看見,單寧在降低反芻動物尿氮排泄方面具有積極的效果,然而,這些研究人員并沒有測定反芻動物排泄物的N2O排放,其降低N2O排放的效果仍需進一步驗證。

反芻動物采食富含CT的飼糧時,超過50%的CT未能被消化而隨糞便排出體外[62-63]。因此,除了通過減少尿中尿素的排泄來減少N2O的排放外,在農田土壤中施用含有CT的反芻動物糞便來減少N2O的排放,為降低N2O排放提供了另一思路。Misselbrook等[64]報道,奶牛采食百脈根單寧,其糞便中檢測到單寧且具有生物活性,糞便中的單寧顯著降低了牛舍以及土壤中產生的NH3。在奶牛飼糧中添加栗子單寧提取物,糞便中脲酶活性和糞氮排泄量均降低[65]。此外,土壤中施用富含白堅木單寧的山羊糞便,土壤N2O的排放量可降低80%～92%[66]。

當前,只有少部分研究測定了單寧對反芻動物排泄物N2O排放的影響。體外研究表明,4種不同濃度的CT和HT均降低了N2O的累積排放速率和通量速率,對N2O的排放產生了顯著的抑制效果,因此,CT和HT都可以通過抑制氨的分解和調控微生物來調節與硝化和反硝化相關的N2O排放[6]。Van Cleef等[67]證明,單寧與蛋白質結合抑制了宿主酶的消化作用和腸道對氨基酸的吸收,在32 d內有效減少了土壤中N2O的排放。Bao等[68]發現,在肉牛飼糧中添加沒食子酸可降低肉牛尿液N2O排放,而尿氮排泄或尿素排泄不受影響,這主要是由于沒食子酸代謝物如鄰苯三酚和間苯二酚的排泄可能抑制了N2O的產生過程。此外,也有部分研究報道了不一致的結果,例如,在肉牛飼糧中補充黑荊單寧并不影響糞便N2O的排放[69]。De Souza等[70]則觀察到金合歡單寧提取物提高了綿羊排泄物的N2O排放。這些研究表明單寧對反芻動物氮利用和N2O排放的影響可能因單寧來源、濃度、分子結構和劑量不同而存在很大差異。綜上可知,植物單寧在減少反芻動物排泄物N2O排放方面具有良好的潛力。雖然植物單寧在減少氮排放方面顯示出良好的潛力,但與其相關的N2O生成的調控因子仍未知,未來應進一步探究植物單寧對N2O生成調控的機制,提高氮利用效率,減少N2O的排放。

4 小結與展望

綜合體內和體外試驗的大量研究結果,可以看出植物單寧具有明顯抑制反芻動物CH4生成和N2O排放的作用,但由于作用的效果受到單寧來源、動物因素和單寧添加量等多方面的影響,導致結果仍存在較大的差異,尤其是在降低飼糧營養成分消化率和影響生產性能方面。未來需要建立有序的研究流程,如體外試驗篩選潛在的單寧提取物,應用單寧測定、結構分析和體外產氣等方法,建立單寧含量、活性、結構和分子質量與CH4產量或氮排泄量之間的相關關系;體內試驗綜合考慮動物和飼糧因素,分析對采食量和瘤胃發酵的影響,并開展長期體內試驗,分析對動物生產性能、動物健康、產品品質和CH4或N2O排放的長期影響。