薯蕷皂苷經PI3K/AKT通路對肝癌Bel-7402細胞增殖和凋亡的影響*

楊茂輝, 冉恒泉, 王何斌, 劉德欽, 李勁

(1.攀枝花學院附屬醫院 肝膽科, 四川 攀枝花 617000; 2.攀枝花市中心醫院 肝膽外科, 四川 攀枝花 617000)

肝癌是臨床上最為常見的嚴重威脅人類健康的惡心腫瘤之一。根據2018年世界衛生組織統計結果表明,肝癌發病率高居前列,是最為常見的癌癥之一[1-2]。雖然近年來隨著醫療技術水平的提高,在針對肝癌的防控上取得了一定的成績,但是由于其發病率會隨著年齡增長而顯著增加[3]。因此不斷尋求新的有效的抗腫瘤藥物具有重要的意義。薯蕷皂苷是一種廣泛存在于人參、柴胡、盾葉薯蕷、黃山藥等傳統中藥中,王淑榮等[4]研究結果表明,其在抗炎、抗衰老、抗骨質疏松、降血糖、抗血栓及抗動脈粥樣硬化等心血管疾病中均發揮著一定的作用,同時研究還認為薯蕷皂苷能夠通過誘導細胞凋亡的方式抑制腫瘤細胞的增殖。磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信號通路已被研究證實在包括肝癌[5-6]、肺癌[7]、胃癌[8]在內的多種腫瘤細胞中扮演著重要的角色。然而,目前薯蕷皂苷在肝癌中的研究較少,且薯蕷皂苷是否能通過調節PI3K/AKT信號通路影響肝癌細胞進展也尚未闡明。因此,本研究通過采用不同劑量薯蕷皂苷干預體外培養的肝癌細胞系,以觀察其對肝癌細胞增殖和凋亡的影響及其與PI3K/AKT信號通路的調節作用,為薯蕷皂苷抗肝癌的分子機制提供了新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌Bel-7402細胞購自中國科學院(上海)細胞庫,貨號BFN60800695。薯蕷皂苷(純度≥98%,貨號D114066)購自上海阿拉丁試劑公司。高糖DMEM由Fisher Scientific公司提供,MTT由Sigma-Aldrich公司提供;AnnexinV-FITC/PI試劑盒由美國BD公司提供,p-PI3K、p-Akt抗體由美國Santa Cruz公司提供;HERAcell 240i CO2恒溫細胞培養箱購自美國Thermo Forma公司,SE300型蛋白質電泳儀、TE22型蛋白質轉膜儀購自美國Hoefer公司,流式細胞儀FACSAriaTM、GBOX型凝膠成像系統及分析軟件購自美國BD公司。

1.2 研究方法

1.2.1細胞培養及分組 將常規復蘇后的人肝癌Bel-7402細胞放置在六孔板中,在高糖DMEM培養液中進行常規培養,每2天進行1次傳代。取對數生長期的肝癌Bel-7402以2×104μL/孔接種于96孔板,待細胞貼壁后每孔加入0、1、2、8 μmol/L的薯蕷皂苷,即分為空白組、薯蕷皂苷低、中、高劑量組[9],并設薯蕷皂苷+抑制劑組,該組每孔加入PI3K/AKT信號通路抑制劑LY294002(10 μmol/L)[10]以及8 μmol/L的薯蕷皂苷。

1.2.2MMT法測定肝癌Bel-7402細胞增殖 各組Bel-7402細胞按照1.2.1的方法處理,分別培養12、24、36、48、72 h后,每孔添加20 μL的MTT(5 g/L),在37 ℃下再孵育4 h,加入二甲基亞砜(每孔150 μL)溶解甲醛晶體,10 min后使用酶標儀測定490 nm的吸光度。吸光度值與細胞活力呈正比,細胞活力與增殖能力呈正比。

1.2.3流式細胞儀檢測肝癌Bel-7402細胞凋亡 收集經1.2.1處理24 h的各組細胞,通過預冷的磷酸緩沖鹽溶液(PBS)漂洗,重懸后2 000 r/min離心5 min,棄上清,加入 Annexin V-FITC 5 μL,輕輕混勻,室溫避光孵育20 min;200 ×g離心5 min,棄上清,再加入10 μL碘化丙啶(PI),輕輕混勻,室溫避光放置,1 h內上流式細胞儀檢測凋亡情況。

1.2.4蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測PI3K/AKT通路蛋白 使用含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解細胞,并在4 ℃下以10 000 r/min離心10 min。采用PierceTM BCA測定提取蛋白的濃度。用電泳分離蛋白質,然后用半干轉移技術轉移到聚偏氟乙烯膜上,將這些膜用5%脫脂奶粉阻斷1 h,然后在4 ℃下以1∶300的兔抗人p-PI3K和p-AKT一抗孵育過夜,然后用HRP標記的山羊抗兔二抗孵育2 h。使用電化學發光(ECL)檢測裝置檢測蛋白質。Bandscan 5.0軟件用于定量蛋白表達。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 薯蕷皂苷對肝癌Bel-7402細胞增殖的影響

MTT結果如表1所示,空白組、薯蕷皂苷低、中、高劑量組肝癌Bel-7402細胞活力比較,差異有統計學意義(F=3.792、32.910、137.610、450.696、411.135,P<0.05);其中與空白組相比較,24、36、48、72 h時,薯蕷皂苷低、中、高劑量組及薯蕷皂苷+抑制劑組肝癌Bel-7402細胞活力下降(P<0.05),且薯蕷皂苷低劑量組在24、36、48、72 h時細胞活力均高于薯蕷皂苷中、高劑量組、薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05),薯蕷皂苷中劑量組在24、36、48、72 h時細胞活力比薯蕷皂苷高劑量組、薯蕷皂苷+抑制劑組高(P<0.05);36、48、72 h時,薯蕷皂苷+抑制劑組的細胞活力低于薯蕷皂苷高劑量組(P<0.05)。

表1 不同時點各組肝癌Bel-7402細胞增殖能力比較Tab.1 Comparison of proliferation ability of hepatocarcinoma cell line Bel-7402 at different time

2.2 薯蕷皂苷對肝癌Bel-7402細胞凋亡的影響

如圖1、表2所示,空白組、薯蕷皂苷低、中、高劑量組、薯蕷皂苷+抑制劑組肝癌Bel-7402細胞凋亡率比較,差異有統計學意義(F=691.521,P<0.05);其中與空白組比較,在24 h后,薯蕷皂苷低、中、高劑量組及薯蕷皂苷+抑制劑組肝癌Bel-7402細胞凋亡率均增高(P<0.05),且薯蕷皂苷低劑量組的凋亡率低于薯蕷皂苷中、高劑量組及薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05),薯蕷皂苷中劑量組細胞凋亡率低于薯蕷皂苷高劑量組、薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05),薯蕷皂苷高劑量組細胞凋亡率低于薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05)。

圖1 流式細胞術檢測薯蕷皂苷對肝癌Bel-7402凋亡的影響Fig.1 Effect of dioscin on the apoptosis of hepatocarcinoma cell line Bel-7402 by flow cytometry

表2 薯蕷皂苷對肝癌Bel-7402凋亡的影響Tab.2 Effect of dioscin on the apoptosis of hepatocarcinoma cell line

2.3 薯蕷皂苷對肝癌Bel-7402細胞PI3K/AKT信號通路的影響

Western Blot結果如圖2所示,空白組、薯蕷皂苷低、中、高劑量組及薯蕷皂苷+抑制劑組肝癌Bel-7402細胞p-PI3K、p-AKT表達比較,差異有統計學意義(F=216.127、467.272,P<0.05);其中與空白組比較,在24 h時,薯蕷皂苷低、中、高劑量組及薯蕷皂苷+抑制劑組肝癌Bel-7402細胞p-PI3K、p-AKT表達均降低(P<0.05),且薯蕷皂苷低劑量組肝癌Bel-7402細胞p-PI3K、p-AKT表達高于薯蕷皂苷中、高劑量組、薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05),薯蕷皂苷中劑量組肝癌Bel-7402細胞p-PI3K、p-AKT表達高于薯蕷皂苷高劑量組、薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05),薯蕷皂苷高劑量組肝癌Bel-7402細胞p-PI3K、p-AKT表達高于薯蕷皂苷+抑制劑組(P<0.05)。

注：(1)與空白組比較,P<0.05;(2)與薯蕷皂苷低劑量組比較,P<0.05;(3)與薯蕷皂苷中劑量組比較,P<0.05;(4)與薯蕷皂苷高劑量組比較,P<0.05。

3 討論

據2015年中國癌癥統計顯示,肝癌是我國最為常見的四種癌癥之一,其發病率和致死率男性明顯高于女性,尤其在60歲以下男性中尤為突出[11]。肝癌具有發病隱匿的特征,只有不到3成的患者可以在早期肝癌進行手術切除或肝移植,而對于中晚期患者通常選擇肝動脈栓塞化療[12-13],雖然在一定程度上延長患者生存期,但是同時高昂的醫療費用給患者及其家庭帶來的沉重的負擔,降低患者的生活質量[14]。因此,迫切需要研究肝癌的相關機制并開發更有效的治療干預措施。

薯蕷皂苷是多種傳統中藥藥材中的有效成分,對多種疾病均有不同程度的治療作用。在心血管疾病方面,以薯蕷皂苷為有效成分的地奧心血康膠囊被廣泛應用于臨床治療冠心病心肌缺血、心絞痛等[15-16];在治療癌癥方面,如李亞等[17]通過薯蕷皂苷干預胃癌細胞,能夠抑制P53的表達,顯著對胃癌細胞的增殖產生抑制;又如茆文莉等[18]研究發現,不同濃度的薯蕷皂苷均能對肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲產生不同程度的影響,并提示可能與PI3K/AKT信號通路有關。在本實驗中,通過MTT實驗發現,空白組肝癌Bel-7402細胞活力比其余組高,各劑量組的細胞活力差異顯著;流式細胞儀結果表明,在24 h后空白組肝癌Bel-7402細胞的凋亡率比其余組低,且各劑量組間差異顯著。表明不同濃度的薯蕷皂苷均能在不同程度上抑制肝癌細胞的增殖和促進肝癌細胞的凋亡,這也與此前宋正偉等[19]在肝癌HepG2細胞中的實驗結果相吻合。PI3K/AKT通路是一種細胞內信號傳導途徑,在肝癌等許多腫瘤細胞中均發現了PI3K/AKT信號通路被激活。當PI3K/AKT信號通路被激活后,p-AKT會促凋亡蛋白失活,進而實現對腫瘤細胞增殖的促進作用,同時活化的AKT還能調控線粒體對細胞色素C的釋放,從而抑制細胞凋亡[20-21]。此外PI3K/AKT信號通路還能夠調控下游信號因子如mTOR,使得細胞快速從G1期進入S期[22]。有研究發現,可以通過薯蕷皂苷抑制PI3K/AKT信號通路來抑制肺癌細胞的增殖[17]。本研究發現,在24 h后,空白組肝癌Bel-7402細胞p-PI3K、p-AKT表達均高其余組,且薯蕷皂苷各劑量組的p-PI3K、p-AKT表達差異具有劑量依賴性。該結果提示在肝癌Bel-7402細胞中,薯蕷皂苷也能影響PI3K/AKT信號通路的表達,顯著下調PI3K及AKT的磷酸化。同時,高劑量薯蕷皂苷和PI3K/AKT信號通路抑制劑聯用后,增殖能力進一步下降,凋亡能力進一步增高,提示在肝癌細胞進展中薯蕷皂苷可能通過抑制PI3K/AKT信號通路激活發揮作用。

綜上所述,薯蕷皂苷可能通過抑制PI3K/AKT信號通路活化來實現對肝癌Bel-7402細胞增殖和凋亡的調控。本研究為薯蕷皂苷在肝癌的中的作用提供了新的見解。