MLMT與MLST在新生隱球菌基因分型中的應(yīng)用研究*

朱鍵, 曹佳非, 康穎倩, 三上襄,Wieland Meyer

(1.貴陽市第二人民醫(yī)院 &貴州醫(yī)科大學(xué)附屬金陽醫(yī)院 消化內(nèi)科, 貴州 貴陽 550081; 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科, 貴州 貴陽 550004; 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 研究生院, 貴州 貴陽 550004; 4.千葉大學(xué) 醫(yī)學(xué)真菌研究中心, 日本 千葉縣 260-8673; 5.悉尼大學(xué) Westmead醫(yī)學(xué)研究所, 澳大利亞 悉尼 NSW2145)

隱球菌是一種常見的條件致病性真菌,當(dāng)機(jī)體免疫功能低下時致病,嚴(yán)重時可危及生命。臨床上常見的致病性隱球菌分別為新生隱球菌(Cryptococcusneoformans,C.neoformans)和格特隱球菌(Cryptococcusgattii,C.gattii)[1]。C.neoformans廣泛存在于世界范圍內(nèi),感染人群以免疫功能低下的患者為主[2]。分子分型可在分子水平上研究病原微生物的流行病學(xué)特征及病原學(xué)特點(diǎn),為病原體的防治及研究提供理論依據(jù)。目前,MLST是常用于C.neoformans基因分型的方法[3]。雖然MLST具有高分辨率、可復(fù)性及穩(wěn)定性強(qiáng)、可實(shí)現(xiàn)在線數(shù)據(jù)共享等特點(diǎn),但其缺點(diǎn)是費(fèi)用較高、耗時。Hanafy等[4]對15條微衛(wèi)星序列進(jìn)行比對,最終挑選出簡單重復(fù)序列(simple squence repeats,SSRs)具有多態(tài)性的3個微衛(wèi)星位點(diǎn)(CNG1、CNG2 及CNG3)作為C.neoformans菌株MLMT的靶點(diǎn)。本研究分別應(yīng)用MLMT及MLST對實(shí)驗(yàn)菌株進(jìn)行基因分型鑒定,探討兩種方法在C.neoformans分子分型中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 菌株來源及相關(guān)信息

22株菌分別來源于國內(nèi)5個城市(北京、上海、南京、廣州及貴陽)17株;日本2個城市(千葉和長崎)5株菌。22株菌中有16株由HIV患者體內(nèi)分離出,4株由鴿糞中分離出,2株未知來源,見表1。經(jīng)Canavanine-glycine-bromothymol blue(CGB)培養(yǎng)基鑒定為C.neoformans。菌株接種于馬鈴薯培養(yǎng)基瓊脂培養(yǎng)基,在30 ℃條件下培養(yǎng)48～72 h備用。

表1 MLMT及MLST各位點(diǎn)引物及擴(kuò)增條件列表Tab.1 List of primer and PCR amplification condition of locus for MLMT and MLST

1.2 研究方法

1.2.1DNA提取、相應(yīng)位點(diǎn)序列PCR擴(kuò)增及測序 按文獻(xiàn)[4]所述,進(jìn)行22株菌DNA提取,應(yīng)用MLMT的CNG1、CNG2及CNG3微衛(wèi)星灶相應(yīng)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行測序;參照共識意見及文獻(xiàn)[3,5],采用MLST的7個位點(diǎn)(CAP59、GPD1、IGS1、LAC1、PLB1、SOD1及URA5)的特異性引物進(jìn)行相應(yīng)的序列PCR擴(kuò)增,擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行測序。各位點(diǎn)引物及PCR擴(kuò)增條件見表1。

1.2.2MLMT分析 按文獻(xiàn)[4]所述計(jì)算各菌株3個微衛(wèi)星灶的不同SSRs(CNG1-TA、CNG2-GA及CNG3-CAT)重復(fù)數(shù)以確定各微衛(wèi)星灶的等位基因型,等位基因型用編號來代表,整合各菌株3個微衛(wèi)星灶的等位基因型即可獲得菌株的MLMT基因型,基因型用數(shù)字編號代表。

1.2.3MLST分析 采用Genetyx.ver.11和ATCG.ver.7對22株菌所測定的MLST的7個位點(diǎn)等位基因序列進(jìn)行處理,處理后序列上傳至網(wǎng)站(https//mlst.mycologylab.org),獲取各菌株每個位點(diǎn)的相應(yīng)等位基因型及序列型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,Fisher精準(zhǔn)檢驗(yàn)對兩種方法分型能力進(jìn)行比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MLMT基因分型及分布

經(jīng)MLMT將22株菌分為7個基因型,分別為MLMT2、14、16、17、29、34及39;在16株臨床菌株中,13株菌基因型為MLMT17;基因型MLMT14、34及39各1株;4株環(huán)境菌株中,3株菌的基因型為MLMT17,而其余1株菌的基因型MLMT29,見表2。3個微衛(wèi)星位點(diǎn)中CNG1的等位基因型為1～5;CNG2的等位基因型為3、4、5;CNG3的等位基因型為1、2及6,見表3。在7個MLMT基因型中,MLMT17最常見(16/22, 72.73% ),該基因型菌株普遍分布于兩個國家各城市,在環(huán)境及患者中均可分離出該基因型菌株;其CNG1、CNG2及CNG3等位基因型為3、5、2, 各微衛(wèi)星灶的SSRs的重復(fù)數(shù)分別為12個TA和GA,7個CAT。見圖1。

圖1 MLMT17的微衛(wèi)星灶(CNG1、CNG2及CNG3)簡單重復(fù)序列Fig.1 Tandem sequence repeatsof micro-satellite(CNG1,CNG2,and CNG3)for MLMT17

表2 新生隱球菌菌株基本信息、MLMT、MLST及整合后基因型Tab.2 Basic information,MLMT,MLST and genotypes list of C. neoforman

表3 不同基因型MLST及MLMT等位基因型結(jié)果Tab.3 Allele type results of MLMT and MLST in different genotypes

2.2 MLST基因分型及分布情況

MLST將22株菌分為4個基因型,分別為MLST5、31、32及66,最常見基因型為MLST5(19/22, 86.36%),可見于兩個國家各城市,在環(huán)境及患者菌株中均可分離出該基因型,見表2。MLST的7個位點(diǎn)中CAP59等位基因型為1和7,GPD1為1和3,IGS1為1和10,LAC1為3、5及12,PLB1為1、2及4,SOD1為1,URA5為1和2。MLST5的7個位點(diǎn)的等位基因譜為1-3-1-5-2-1-1。見表3。

2.3 MLMT與MLST整合基因型

綜合MLST及MLMT結(jié)果將22株菌鑒定為7個MLMT/MLST基因型,分別為2/66,14/32,16/5, 17/5,34/5,39/5及29/31。中國菌株中有6個基因型(14/32,16/5,17/5,34/5,39/5及29/31),日本菌株有2個(2/66和17/5)。MLMT17/MLST5為兩國菌株共有基因型,在所有基因型中所含菌株數(shù)最多(16/22,72.73%) 。見圖2。

圖2 22株新生隱球菌基因型分布Fig.2 Genotype distribution of 22 C.neoformans Strains

2.4 菌株MLMT與MLST基因型對比

MLMT17菌株經(jīng)MLST方法確定為MLST5外,MLMT16、34、39菌株也被鑒定為MLST5。MLMT2、14及29分別對應(yīng)MLST66、32及31,見表3。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件比較兩種方法在基因分型中分辨能力差異,結(jié)果顯示兩種方法在C.neoformans菌株基因分型比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

MLST技術(shù)是通過對保守基因的基因序列進(jìn)行分析揭示等位基因突變,從而對病原體達(dá)到分型鑒定的目的。MLMT是建立在微衛(wèi)星DNA簡單重復(fù)序列的多態(tài)性基礎(chǔ)上,對病原體進(jìn)行分型鑒定。兩種方法在C.neoformans分型鑒定中均具有高分辨力,可復(fù)性及穩(wěn)定性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)[4,6]。MLST研究表明C.neoformans菌株基因型具有地區(qū)特異性。例如：東亞地區(qū)主要的基因型為MLST5[7-9];MLST4及6在泰國常見;在印尼、印度、拉丁美洲及民主剛果共和國MLST93常見[10-13];而在歐洲和地中海地區(qū)MLST23是這些地區(qū)的優(yōu)勢基因型[14]。這種差異不僅表現(xiàn)在地區(qū)之間,而且環(huán)境和臨床菌株之間也存在一定的差異。通過MLST對C.neoformans的國內(nèi)臨床菌株進(jìn)行分型,提示MLST5是主要的基因型[15-16],而對C.neoformans分型也發(fā)現(xiàn)環(huán)境和臨床菌株的主要基因型也存在明顯不同[19]。不但如此,不同基因型的C.neoformans菌株毒力也不同[20]。研究表明MLST5是毒力強(qiáng)的基因型,有較高的致殘及致死率[21-22]。本研究中MLST5菌株占比最高(19/22,86.36%),與有關(guān)報(bào)道相一致[7]。通過MLMT方法對MLST5菌株進(jìn)行基因分型中發(fā)現(xiàn)MLMT17所占比例最大(16/19,84.2%),進(jìn)一步提示MLMT17/MLST5是國內(nèi)及日本C.neoformans菌株中最常見的基因型。與 MLMT17/MLST5相比,MLMT16/MLST5及MLMT39/MLST5菌株僅在1個微衛(wèi)星灶有差別,考慮這兩個基因型與MLMT17/MLST5有親緣關(guān)系。與有關(guān)報(bào)道[17-18]不符的是,在環(huán)境菌株基因型中,MLST5為本次研究中最常見基因型,考慮可能與本次研究納入環(huán)境樣本量少有關(guān),需加大樣本量進(jìn)一步研究分析。

Meyer等[3]通過辛普森指數(shù)對MLST應(yīng)用于C.neoformans基因多樣性研究進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),至少需要7個保守基因/管家基因才可滿足新生隱球菌菌株基因分型鑒定的需求。Hanafy等[4]應(yīng)用3個微衛(wèi)星灶(CNG1、CNG2及CNG3)的簡單重復(fù)序列進(jìn)行新生隱球菌基因分型鑒定,分辨能力達(dá)D=0.992。本研究應(yīng)用兩種方法對22株C.neoformans進(jìn)行分型鑒定,通過MLMT產(chǎn)生7個基因型,而MLST產(chǎn)生4個基因型。雖然MLMT產(chǎn)生基因型多于MLST,但是統(tǒng)計(jì)學(xué)分析兩種分型方法無明顯差異,提示MLMT與MLST方法效果相當(dāng)。相比MLST,包含有CNG1、CNG2及CNG3微衛(wèi)星灶的MLMT方法具有省時,高效,費(fèi)用低,并且操作簡單的優(yōu)點(diǎn)。本研究在MLST結(jié)果分析中發(fā)現(xiàn)MLMT34也屬M(fèi)LST5,而該基因型與MLMT17的3個微衛(wèi)星灶均存在簡單重復(fù)序列重復(fù)數(shù)的差異,提示MLMT方法可作為MLST分型方法的補(bǔ)充。MLMT17/MLST5與MLMT39/ST5之間在表型、毒力、耐藥等方面有無差異有待進(jìn)一步研究及探討。

綜上所述,本研究通過MLMT及MLST方法對C.neoformans菌株進(jìn)行基因分型顯示MLMT17/MLST5是我國及日本C.neoformans中常見的基因型。MLST和MLMT兩種方法所獲得的結(jié)果高度一致。與MLST方法相比,包含CNG1、CNG2及CNG3微衛(wèi)星灶的MLMT方法可作為MLST替代或補(bǔ)充,便于在C.neoformans菌株分子流行病學(xué)及遺傳背景研究中推廣使用。