氧化低密度脂蛋白對人臍靜脈內(nèi)皮細胞增殖及 circRNA-CER表達的影響*

陳萬, 王小靜, 劉晗, 趙鄭波

(1.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院 心內(nèi)科, 重慶 400050; 2.重慶市九龍坡區(qū)人民醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科, 重慶 400050; 3.重慶市渝北區(qū)中醫(yī)院 心內(nèi)科, 重慶 401121)

動脈粥樣硬化是導致眾多心血管疾病的基礎病理改變,其發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢,給全球經(jīng)濟社會的發(fā)展帶來了嚴重的負擔[1]。目前臨床上主要通過降脂療法延緩疾病的進展,卻無法完全抑制或逆轉(zhuǎn)疾病的進程。因此探明動脈粥樣硬化的發(fā)病機制有助于為該病的防治提供新的診治靶點。動脈粥樣硬化的發(fā)病機制極為復雜,學術(shù)界中存在脂質(zhì)浸潤、血管內(nèi)皮損傷、血管平滑肌細胞過度增殖等多種假說。其中,血管內(nèi)皮細胞損傷是誘導動脈粥樣硬化的始發(fā)因素,多項研究證實改善血管內(nèi)皮功能具有抑制動脈粥樣硬化的作用,提示保護血管內(nèi)皮細胞是一項潛在有效的抗動脈粥樣硬化治療策略[2]。CircRNA是一類含有共價閉環(huán)結(jié)構(gòu)的RNA,具有表達豐度高、穩(wěn)定性強(抵抗核酸外切酶)、保守性強、時空及組裝表達特異性等特點,因此可成為潛在的疾病生物標志物。CircRNA常以“海綿樣”作用吸附miRNA或與蛋白結(jié)合發(fā)揮生物學作用,近年來發(fā)現(xiàn)circRNA也可編碼蛋白或短肽,從而在生長發(fā)育、惡性腫瘤及心血管疾病等發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3-5]。有研究報道,hsa_circ_0010729通過miR-186/HIF-1α調(diào)控軸影響血管內(nèi)皮細胞的增殖和凋亡[6]。提示circRNA與血管內(nèi)皮細胞的功能密切相關(guān),其有望成為保護血管內(nèi)皮細胞免受氧化低密度脂蛋白(oxidized lipoprotein, ox-LDL)的損害、抵抗動脈粥樣硬化發(fā)病的潛在新型靶點。本研究經(jīng)前期篩選發(fā)現(xiàn)circRNA-CER在ox-LDL刺激下的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cell,HUVEC)表達明顯下調(diào)。然而,circRNA-CER在動脈粥樣硬化中對血管內(nèi)皮細胞功能的調(diào)節(jié)作用和具體生物學機制還未完全闡明,其是否能成為診治動脈粥樣硬化的新靶點還有待進一步評估。本研究旨在探討circRNA-CER在ox-LDL的誘導下對血管內(nèi)皮細胞增殖的影響以及其作為miRNA“分子海綿“機制的探討,以期為動脈粥樣硬化的靶向治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

HUVEC購于武漢原生原代公司,胎牛血清購于Gibico公司,1640培養(yǎng)基購于Hyclon公司,ox-LDL購于廣州弈源生物。質(zhì)粒由上海漢恒公司合成。miRNA-136 mimic及檢測試劑盒購于廣州銳博生物科技有限公司,LipofectamineTM2000購于Invitrogen公司,CCK8購自MCE公司,TRIzol購于ThermoFisher公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑、SYBR Green購于TAKARA公司。引物由生工設計并合成;RIPA裂解液、PMSF、BCA試劑盒、6X蛋白上樣緩沖液、熒光素酶報告基因檢測試劑盒購于碧云天公司;GAPDH、VEGF抗體購于武漢三鷹公司;熒光二抗購于LI-COR公司。

1.2 研究方法

1.2.1HUVEC細胞培養(yǎng)及處理 培養(yǎng)使用含有20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基(Hyclon),放置于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞匯合度為60%～70%時進行ox-LDL刺激、質(zhì)粒或miRNA mimic轉(zhuǎn)染。ox-LDL按濃度梯度(0、40、60、80、100及200 mg/L)處理24 h或以100 mg/L按時間梯度(0、6、12、24及48 h)處理。后續(xù)實驗按照ox-LDL 100 mg/L處理細胞24 h。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染使用轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000,按照說明書操作,6 h后換液。pcDNA3.1質(zhì)粒作為對照組。

1.2.2qRT-PCR實驗 使用TRIzol法提取細胞總RNA,用一步法逆轉(zhuǎn)錄試劑按1 μg RNA反應體系進行逆轉(zhuǎn)錄,反應程序為：37 ℃ 15 min,85 ℃ 15 s。采用SYBR Green熒光染料進行實時定量PCR反應,程序為：95 ℃ 3 min,95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共進行39個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔。以GAPDH作為內(nèi)參照。2-ΔΔCt法計算相對表達量。miRNA-136的檢測使用專用試劑盒。引物序列：CircRNA-CER 上游引物為5′ -CTGGTGCAGTGGAAGCAGAG-3′ ,下游引物為5′ - CGACCCTCCATTGCTCTTCT -3′;GAPDH 上游引物為5′ -GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′,下游引物為5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA -3′。

1.2.3CCK8實驗 在96孔板中接種并處理細胞,檢測時加入CCK8溶液(10 μL/孔)和培養(yǎng)基(90 μL/孔),分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1對照組和circRNA-CER過表達質(zhì)粒組。細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h后,使用酶標儀測量吸光度OD450值。

1.2.4Western blot檢測 使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白,其中添加PMSF以防止蛋白降解,BCA法進行蛋白濃度的測定,加入6×蛋白上樣緩沖液,100 ℃加熱10 min。使用10% SDS-PAGE凝膠進行80 V恒壓電泳,將分離后的蛋白轉(zhuǎn)至NC膜,室溫下使用5%脫脂奶粉封閉1 h,4℃孵育一抗GAPDH (1∶10 000)、VEGF (1∶500)過夜。復溫后用TBST緩沖液洗膜3次,避光并于室溫中孵育熒光二抗(1∶10 000)1 h,TBST緩沖液洗膜3次。LI-COR熒光成像儀中進行成像,通過Quantity One軟件分析灰度值。

1.2.5熒光素酶報告基因 由上海漢恒生物科技有限公司分別構(gòu)建circRNA-CER、VEGF 3′UTR熒光素酶報告基因質(zhì)粒。在96孔板中接種細胞并進行miR-136 mimic處理,同時轉(zhuǎn)染circRNA-CER或VEGF 3′UTR報告質(zhì)粒,以mimic NC處理作為對照。使用熒光素酶報告基因檢測試劑盒(碧云天)按操作說明進行檢測。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 CircRNA-CER在ox-LDL刺激下的血管內(nèi)皮細胞中低表達

結(jié)果如圖1所示,ox-LDL對HUVEC中circRNA-CER的表達呈現(xiàn)濃度與時間的依賴性。隨ox-LDL濃度的增加,circRNA-CER表達呈下調(diào)趨勢,并在100 mg/L ox-LDL處理時差異有統(tǒng)計學意義(下降72.9%,P<0.05)。在以ox-LDL 100 mg/L刺激后發(fā)現(xiàn),circRNA-CER表達隨處理時間延長呈下調(diào)趨勢,在24 h處發(fā)生下調(diào)(下降73.5%,P<0.05)。繼續(xù)加大ox-LDL濃度或延長處理時間對circRNA-CER的表達抑制影響有限。故circRNA-CER在100 mg/L ox-LDL處理HUVEC 24 h后表達下調(diào)最顯著,選擇以該濃度及時間作為后續(xù)實驗條件。

注：A為circRNA-CER在ox-LDL濃度梯度刺激24 h后的表達,B為circRNA-CER在ox-LDL 100 mg/L濃度下隨時間梯度的表達;(1)與0 mg/L ox-LDL組比較,P<0.05;(2)與0 h比較,P<0.05。

2.2 驗證circRNA-CER表達質(zhì)粒效率

用circRNA-CER過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HUVEC,以空載質(zhì)粒作為對照。24 h后運用qRT-PCR檢測circRNA-CER的表達量。圖2結(jié)果顯示：過表達組中circRNA-CER的表達水平顯著高于對照組(P<0.01)。

2.3 過表達circRNA-CER阻止ox-LDL發(fā)揮抑制HUVEC增殖的作用

通過CCK8實驗檢測細胞增殖能力,結(jié)果如圖3所示,與對照組相比,ox-LDL處理組細胞在450 nm處OD值降低(P<0.05),而在ox-LDL刺激的同時過表達circRNA-CER可逆轉(zhuǎn)ox-LDL單獨處理引起的細胞增殖抑制效應。

2.4 CircRNA-CER結(jié)合miR-136影響VEGF表達

通過qRT-PCR檢測miR-136的細胞表達水平。圖4A結(jié)果顯示,過表達circRNA-CER后miR-136的表達量較對照組下調(diào)(下降53.3%,P<0.05);Western blot實驗證實,在circRNA-CER過表達的同時增加miR-136表達量可抑制單獨過表達circRNA-CER對VEGF蛋白表達的促進作用,提示circRNA-CER對 VEGF的表達調(diào)控受miR-136的影響(圖4B)。熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,circRNA-CER與miR-136以及miR-136與VEGF 3′UTR之間存在直接結(jié)合位點(圖4C)。

3 討論

作為miRNA發(fā)揮“分子海綿”樣作用是circRNA最早發(fā)現(xiàn)、研究最多的主要生物學功能之一[7]。circRNA具有與競爭性內(nèi)源RNA(ceRNA)相似的作用機制,即通過“吸附”miRNA進而解除miRNA對下游靶基因的表達抑制,最終恢復靶基因的表達[8]。已有大量文獻報道,“circRNA-miRNA-靶基因”調(diào)控軸參與多種疾病的發(fā)病[9-12]。除此之外,circRNA與RNA結(jié)合蛋白的結(jié)合和相互作用是其另一大作用機制[13]。而新近發(fā)現(xiàn)的circRNA編碼蛋白進一步豐富了基因調(diào)控的多樣性[14-16]。而在血管形成和發(fā)育中,VEGF信號傳導發(fā)揮了關(guān)鍵的調(diào)控作用。VEGF誘導相關(guān)基因表達,調(diào)控血管的通透性并促進血管內(nèi)皮細胞的遷移、增殖和存活[17]。有研究表明,在ox-LDL的損傷刺激下激活VEGF可發(fā)揮對血管內(nèi)皮細胞的保護作用,從而起到抗動脈粥樣硬化的效果[18]。因此,探索調(diào)控VEGF表達的分子機制具體重要的意義。既往研究表明,部分circRNA例如circPDS5B、circRNA_06354可通過miRNA調(diào)控血管內(nèi)皮細胞中VEGF的表達[19-20]。然而,其在ox-LDL導致的血管內(nèi)皮細胞損傷的相關(guān)研究中卻機制不明。

本研究檢測到HUVEC在ox-LDL的濃度和時間梯度刺激下,細胞中circRNA-CER的表達呈下調(diào)趨勢。在構(gòu)建并轉(zhuǎn)染circRNA-CER過表達質(zhì)粒后,通過CCK8實驗發(fā)現(xiàn),ox-LDL處理抑制HUVEC細胞增殖,而過表達circRNA-CER可消除該損傷效應,從而起到在動脈粥樣硬化中保護血管內(nèi)皮細胞功能的作用。機制上,本研究還驗證circRNA-CER對VEGF的表達具有促進作用。隨后在篩選和驗證后發(fā)現(xiàn)circRNA-CER可抑制miR-136的表達,而在同時干預兩者后可阻斷circRNA-CER對VEGF的表達促進作用,提示circRNA-CER通過miR-136影響VEGF表達。通過熒光素酶報告基因,也進一步證明了circRNA-CER與miR-136以及miR-136與VEGF 3′UTR的直接結(jié)合,提示circRNA-CER可作為miR-136的“分子海綿“解除其對靶基因VEGF的表達抑制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn) circRNA-CER在ox-LDL刺激下的血管內(nèi)皮細胞中顯著下調(diào)表達,該分子能夠有效地抵抗ox-LDL對血管內(nèi)皮細胞增殖的抑制作用,具有調(diào)控動脈粥樣硬化發(fā)病的潛能。circRNA-CER有望成為動脈粥樣硬化的新型診療靶點。除外,本研究后續(xù)將繼續(xù)完善分子研究并引入動物疾病模型,以期深入、全面的探討circRNA-CER在動脈粥樣硬化中的生物學作用和機制。